油菜亚基因组杂种和亲本的基因差异表达研究

论文摘要

甘蓝型油菜（Brassica napus,AnAnCnCn2n=38）是一种重要的油料作物和生物能源载体,它起源于欧洲地中海地区,由白菜型油菜（Brassica.rapa,ArAr2n=20）和甘蓝（Brassica oleracea,CoCo2n=18）天然杂交,自然加倍而来。作为一种栽培作物,随着产量潜力的不断提升和品质性状的改良,其栽培面积和地域不断扩大,遍布亚洲,欧洲,北美和澳洲。然而,由于其较短的栽培历史和高强度的现代育种,使其遗传基础相对狭窄。育种工作者们试图通过各种途径来丰富其遗传基础,其中通过种间杂交渗入外源基因组的遗传成份来合成甘蓝型油菜就是一种行之有效的方法。事实上,在合成的甘蓝型油菜中已经发现一些新的遗传变异,如染色体重组、DNA序列丢失、DNA甲基化水平变化和基因表达的改变等。杂种优势在农业上被广泛地利用来提作物的高籽粒产量,而且利用杂种优势的作物数量在不断增加。在许多作物中的研究表明亲本和杂种间的基因差异表达是理解杂种优势分子基础的重要方法,如小麦,水稻和玉米。孙逢吉1943年在中国第一次报道了芸苔属物种间杂种的生物学产量杂种优势。随后的许多研究都对油菜籽粒产量的杂种优势程度进行了评价。近年来,又发现了新型甘蓝型油菜和常规甘蓝型油菜间存在着较强的杂种优势,进一步的研究表明其中一些从外源基因组渗入甘蓝型油菜的等位基因对油菜籽粒产量的增加有利。为了深入理解新型甘蓝型油菜及其亲本,新型甘蓝型油菜和甘蓝型油菜组合间基因表达谱的差异对杂种优势的影响,主要进行了以下6个方面的研究:1.利用5个含有白菜型油菜Ar基因组成分或埃塞俄比亚芥Cc基因组成分的新型甘蓝型油菜作母本,5个甘蓝型油菜品种作父本,按NCⅡ设计配制杂交组合得到25个亚基因组间杂种。这25个杂交种的平均中亲优势和超亲优势分别为33.3%和17.0%。其中7个杂种的中亲优势大于40%,10个杂种的超亲优势大于20%。2.选择3个新型甘蓝型油菜以及合成它们的原始亲本共计9份材料为研究对象,利用cDNA-AFLP基因表达差异显示技术分析新型甘蓝型油菜和它们的原始亲本间的一组基因表达谱,32对引物组合获得1167个转录获得片段（Transcript-derivedFragment,TDF）。通过分析表达谱发现,有超过60%的TDF在新型甘蓝型油菜及其甘蓝型油菜亲本间存在差异表达。3.从25个亚基因组间杂交组合中,选择了9个组合,同样利用cDNA-AFLP基因表达差异显示技术分析亚基因组间杂种和甘蓝型油菜亲本间的另一组基因表达谱,32对引物组合获得总计为1231个的TDF。通过对该组表达谱的分析,发现TDF只在亲本之一中出现的表达模式在7个不同的表达模式中占主导地位,另外显性、超显性和负显性表达模式次之,加性效应最少。4.通过分析单个差异表达的TDF与杂种产量表现,中亲优势和超亲优势的相关性,发现同一TDF对相同性状的不同数据类型,效应方向是一致的,但对不同的性状的相同数据类型,效应方向则不定。对于不同数据类型的分析发现:杂种和亲本的表现,TDF为负效应的数量多于正效应的,负效应TDF占58.1%;其它两类,则是正效应的数量多于负效应的,中亲优势的正效应TDF占54.8%,超亲优势的正效应TDF占75.4%。5.回收,克隆和测序了近40个差异表达的TDFs,并对其中20个TDFs的序列进行深入电子拼接分析。首先在NCBI和TAIR网站上搜索同源序列,下载同源序列,然后使用Bioedit软件构建contig,并设计引物验证预测结果。另外,根据对cDNA-AFLP的实验操作经验累积和理解的加深,本研究提出了一个比较可行的cDNA-AFLP改进方案。6.将杂种优势相关TDF转化为分子标记运用到QTL作图研究中验证所得TDF与产量性状相关QTL的相关性。7个杂种优势相关TDF定位在TN分子标记遗传连锁图的12个连锁群上。QTL扫描之后发现其中4个TDF转化的7个标记落于TN群体23个籽粒产量相关性状QTL的置信区间,预示着这些TDF确实可影响油菜的籽粒产量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 油菜杂种优势利用
• 1.2 杂种优势机理的假说
• 1.2.1 显性假说
• 1.2.2 超显性假说
• 1.2.3 上位性假说
• 1.3 遗传距离与杂种优势
• 1.4 基因差异表达的几种研究方法
• 1.4.1 DDRT-PCR技术
• 1.4.2 cDNA-AFLP技术
• 1.4.3 抑制差减杂交法（SSH）
• 1.4.4 基因芯片技术（Microarray）
• 1.5 基因的差异表达与杂种优势
• 1.6 差异表达基因cDNA片段的分离、克隆与功能分析
• 1.7 数量性状位点与杂种优势
• 1.7.1 遗传标记的发展与利用
• 1.7.2 遗传连锁图的构建
• 1.7.3 QTL定位的原理与方法
• 1.7.3.1 单标记分析法（Analysis of Variance,ANOVA）
• 1.7.3.2 区间作图法（Interval Mapping,IM）
• 1.7.3.3 复合区间作图法（Composite Interval Mapping,CIM）
• 1.7.3.4 混合型线性模型复合区间作图法（Mixed Composite Interval Mapping,MCIM）
• 1.7.3.5 多重区间作图法（Multiple Interval Mapping,MIM）
• 1.7.4 甘蓝型油菜的QTL定位与分子标记辅助选择
• 1.8 植物的多倍化与种质资源的创新
• 1.8.1 多倍化后基因组的遗传变化
• 1.8.2 多倍化后基因表达的变化
• 1.8.2.1 基因的表达与沉默
• 1.8.2.2 多倍体中重复基因表达的调节机制
• 1.9 甘蓝型油菜的人工合成
• 1.9.1 人工合成甘蓝型油菜研究进展
• 1.9.2 本实验室合成新型甘蓝型油菜的研究进展
• 2 研究目的与意义
• 2.1 目的
• 2.2 意义
• 3 新型甘蓝型油菜与甘蓝型油菜及其芸薹属内其它亲本间的遗传分析和亚基因组间杂种的杂种优势表现
• 3.1 实验材料和田间试验
• 3.2 AFLP分析方法（见附录1）
• 3.3 分子标记数据处理方法
• 3.4 田间数据分析方法
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 AFLP分子标记分析结果
• 3.5.2 新型甘蓝型油菜的遗传组成
• 3.5.3 实验材料间的遗传相似性分析
• 3.5.4 亚基因组间杂种的杂种优势表现
• 3.5.5 亚基因组间杂种的农艺性状表现及杂种优势与遗传距离的相关性
• 3.6 小结
• 4 CDNA-AFLP基因差异表达分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 cDNA-AFLP实验方法（见附录2）
• 4.2.3 差异TDF的记录与差异表达程度的计算
• 4.2.4 TDF的回收,重扩增和PCR产物的纯化
• 4.2.5 纯化PCR产物的克隆与测序
• 4.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（萨姆布鲁克等,2002）
• 4.2.5.2 目的片段与T载体的连接和转化
• 4.2.5.3 克隆片段的鉴定
• 4.2.5.4 克隆片段测序
• 4.2.6 测序结果的分析方法
• 4.2.7 两步法RT-PCR（见附录3）
• 4.2.8 基因预测软件EuGene'Hom
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 总RNA质量检测
• 4.3.2 新型甘蓝型油菜及其芸薹属亲本间的表达谱分析
• 4.3.3 亚基因组间杂种及其亲本间的基因表达谱分析
• 4.3.4 TDF差异展示类型与杂种表现和杂种优势的相关分析
• 4.3.5 单个差异展示的TDF与杂种表现和杂种优势的关系
• 4.3.6 差异片段的回收
• 4.3.7 重扩增片段的纯化与克隆
• 4.3.8 测序TDF的BLAST结果和功能预测
• 4.3.9 引物设计和引物在DNA水平上的扩增效果
• 4.3.10 设计引物RT-PCR扩增效果
• 4.3.11 半定量RT-PCR对TDF在亚基因组间杂交组合中的差异表达进行验证
• 4.4 小结
• 5 差异表达TDF的定位和QTL分析
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 SSR引物的设计
• 5.2.2 TN群体的亲本多态性筛选和遗传作图
• 5.2.2.1 SSR引物和TDF特异引物以及TRAP引物的筛选
• 5.2.2.2 遗传作图与QTL分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 SSR引物的设计及其扩增情况
• 5.3.2 多态性筛选结果
• 5.3.3 杂种优势相关TDF的染色体定位和QTL定位
• 5.3.3.1 TN群体的染色体定位结果
• 5.3.3.2 TN DH群体定位的SSR和TRAP标记区间的QTL分布
• 1群体农艺性状与4个多态性标记的单标记分析'>5.3.3.3 HT RIL和HT RIL-BC₁群体农艺性状与4个多态性标记的单标记分析
• 5.3.3.4 TN图谱与HT图谱的对比分析
• 5.4 小结
• 6 讨论
• 6.1 新甘蓝型油菜的合成策略
• 6.2 遗传变异和杂种优势
• 6.3 新型甘蓝型油菜与甘蓝型油菜间的基因差异表达
• 6.4 新TDF在亚基因组间杂种中的表达及其与杂种优势的关系
• 6.5 杂种优势相关TDF的染色体定位和QTL分析
• 6.6 利用网上序列信息进行同源比对及电子克隆的策略
• 6.7 关于网上芸薹属物种EST序列信息的挖掘及利用的一点建议
• 6.8 关于改进cDNA-AFLP基因表达差异显示技术的一点想法
• 参考文献
• 附录1（AFLP技术流程）
• 附录2（CDNA-AFLP技术流程）
• 附录3（两步法RT-PCR技术流程）
• 作者简介
• 与博士论文有关的论文和会议摘要
• 致谢