注射用大蒜油固体脂质纳米粒的研究

论文摘要

作为中药现代化的最前沿的创新技术，纳米中药必将成为中药现代化中的重要组成部分，这不仅可以大大提高中药的现代化和标准化，加速中药向国际市场进军的步伐，而且还可以对中药的发展产生革命性的影响。本文以具有抗真菌、抑肿瘤、降血脂等较强药理活性的大蒜油为模型药物，运用高压匀质法和熔融乳化超声法制备了固体脂质纳米粒。利用大蒜油与脂质良好的相容性，既解决了大蒜油水溶性差的问题，又提高了固体脂质纳米粒载药量。本论文首先分离纯化了大蒜油中二烯丙基二硫化物（DADS）和二烯丙基三硫化物（DATS），制备了大蒜油及其制剂的质量控制用对照品：利用精制大蒜油制备了大蒜油固体脂质纳米粒，并用冷冻干燥技术制备大蒜油固体脂质纳米粒冻干制剂，提高了其贮存稳定性；采用中药指纹图谱作为控制制剂质量的手段；最后通过大鼠体内药动学和组织分布研究揭示了大蒜油固体脂质纳米粒的体内行为的规律。采用制备液相纯化了GO中二种主要组分DATS和DADS，HPLC、GC-FID和GC-2ECD的纯度均达到95％以上；降解动力学研究表明DATS和DADS在不同pH溶液中有一定的降解，pH＞13时，降解速度加快；DATS和DADS在20％血浆和10％不同组织匀浆液中的降解比非生物样品中的快得多。采用GC-MS法确证了DATS主要降解产物为DADS。以单硬脂酸甘油酯为脂质材料，卵磷脂和泊罗沙姆188为乳化剂，采用高压匀质法和熔融超声法制备了大蒜油固体脂质纳米粒。二种方法制备的大蒜油固体脂质纳米粒粒径小，包封率均在90％以上。通过单因素实验考察了工艺因素（如加入顺序、匀化压力和次数、超声功率和时间等）和处方因素（脂质相种类和用量、乳化剂浓度、乳化剂比例和大蒜油用量）对GO-SLN粒径大小及分布的影响，并进一步通过正交设计优化了处方。最佳处方的大蒜油固体脂质纳米粒粒径为106.5±40.3nm，包封率为98.6％±1.8％。利用冷冻干燥技术，通过优化冷冻干燥的工艺和处方，将GO-SLN制备成具有良好外观和再分散性的冻干制剂，GO损失低于10％，提高了制剂的稳定性。冻干保护剂对冻干纳米粒的质量有很大的影响。使用单一保护剂时，再分散性均较差，葡萄糖、果糖、山犁醇的处方则出现了萎缩、起泡，部分产品发生喷瓶，外观很差。使用混合保护剂时，有葡萄糖和果糖的处方依然出现起泡、萎缩的现象，而其他处方的外观均较好。从再分散角度看，海藻糖和麦芽糖有提高再分散速度的作用，海藻糖更为明显。最佳处方为10％海藻糖和10％蔗糖，手摇振动的再分散时间小于10s，再分散后的粒径从106.5nm长至155.3nm，能够满足临床要求。显微摄影技术观察了冻干纳米粒的微观形态。残留水分研究表明，未经过二次升温干燥的冻干品的残余含水量仅占5.4％，自由水基本完全除去。通过室温减压干燥可去除部分结合水（2.2％），热重分析法的加热条件不同测得残留水分的比例也有所差异。100℃加热使冻干品产生严重的萎缩、变色，所测残留水分比例较大，有可能是GO挥发的结果。稳定性研究表明，GO-SLN制成冻干品后，依然对光和热不稳定。长期留样观察结果表明，在4℃避光条件下，GO-SLN冻干品基本稳定，含量和再分散后粒径基本不变。从粒子形态、粒径大小及分布、药物分散状态、包封率和体外释放行为方面对GO-SLN进行表征。采用透射电镜观察了自制的GO-SLN和DATS-SLN的形态，结果表明所制得的纳米粒均为表面圆整的类球形粒子。采用光子相关光谱法测定了自制SLN的粒径和分布，相同优化处方的GO-SLN粒径大小顺序为熔融超声法＞高压乳匀法。以电泳法测定了GO-SLN的ζ电位，结果表明本研究制得的纳米粒表面带负电荷，空白SLN的ζ电位为-9.9±6.6mv，3～4天就出现纳米粒的聚集分层，稳定性较差；优化处方的GO-SLN的ζ电位冻干前为-31.9±16mv，能维持40～45天未见可见颗粒，冻干后为-34.7±9.6mv。冻干前后比较可知，冷冻干燥没使ζ电位发生很大变化。DSC法研究了药物在SLN中的分散状态，结果表明制成SLN后，大部分药物与脂质形成固体溶液，均匀分散在脂质材料中，使脂质的结晶度也有所下降。包封率是SLN的一个重要的测定指标。本研究中比较了葡聚糖凝胶过滤法、超速离心法、超滤法和冷冻聚结过滤法。结果表明，超速离心法和冷冻聚结过滤法的测定结果比较接近，葡聚糖凝胶过滤法结果偏低，超滤法对GO完全截留。体外释放的研究表明GO-SLN在体外经轻微突释后缓慢释放。分别采用HPLC法和GC法建立了注射用GO-SLN的标准指纹图谱，相似度评价结果良好，相似系数均在0.99以上，可作为控制注射用GO-SLN的质量标准。最后研究了大鼠颈静脉注射GO-SLN和GO注射液后的体内药动学，并比较了两种制剂的组织分布。药动学研究结果表明，GO制备成SLN后加快了其向组织分布的速度，减少了在血液中驻留时间，GO-SLN-的MRT（13.8 min）比GO注射液的MRT（19.5 min）短，但Cmax、AUC均为GO注射液的近两倍，生物利用度有较大的提高。组织分布研究结果表明，GO与脂质结合形成SLN后，在体内有释放的过程，一定程度上减少了体内酶对GO的代谢和破坏，延长了GO在组织中的作用时间。

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前言

第一章大蒜油中二硫化合物和三硫化合物的纯化和降解动力学研究

1.试药与仪器

1.1 试药

1.2 仪器

2.方法与结果

2.1 DADS和DATS的纯化

2.1.1 制备液相色谱条件

2.1.2 纯化操作

2.1.3 纯度鉴别

2.2 在不同pH缓冲液中的降解动力学研究

2.2.1 色谱条件

2.2.2 贮备液的配制

2.2.3 标准曲线的绘制

2.2.4 精密度

2.2.5 在不同pH水溶液中的水解速率测定

2.3 DADS和DATS在20％血浆和10％不同组织匀浆中的降解动力学研究

2.3.1 生物样品的制备

2.3.2 生物样品中DATS和DADS含量测定方法的建立

2.3.3 DATS在血浆和不同组织中降解速率的测定

2.4 DATS降解产物的确证

3.讨论

4.本章小结

5.参考文献

第二章大蒜油固体脂质纳米粒的制备及冷冻干燥的研究

第一节大蒜油固体脂质纳米粒的制备

1.材料与仪器

2.方法与结果

2.1 制备工艺的考察

2.1.1 制备方法的选择

2.1.2 温度的选择

2.1.3 乳化剂的加入方法

2.1.4 油相和水相的加入方式

2.1.5 制备初乳的剪切转数速和时间

2.1.6 高压匀质法及循环次数

2.1.7 超声功率和时间的影响

2.2 处方的优化

2.2.1 脂质相的选择

2.2.2 脂质相浓度的影响

2.2.3 乳化剂浓度和配比的考察

2.2.4 大蒜油用量的影响

2.2.5 正交设计优化处方

3.讨论

3.1 制备方法的选择

3.2 脂质材料的选择

3.3 优化处方

3.4 中药油状提取物制备SLN的问题

4.本节小结

第二节大蒜油固体脂质纳米粒冷冻干燥的研究

1.材料与仪器

2.GO-SLN冷冻干燥处方和工艺研究

2.1 冷冻干燥简介

2.2 冻干工艺的研究

2.3 冷冻融化试验筛选冻干保护剂

2.4 冻干处方优化

2.4.1 单一保护剂

2.4.2 混合保护剂

2.4.3 冻干保护剂浓度对药物含量的影响

2.5 冻干制剂的质量评价

2.5.1 冻干样品的微观形态和结构

2.5.2 冻干纳米粒残留水分考察

2.5.3 冻干纳米粒稳定性考察

3.讨论

4.本章小结

参考文献

第三章 GO-SLN的理化性质的研究

1.材料与仪器

2.方法与结果

2.1 外观

2.2 透射电镜法观察SLN形态

2.3 粒径的测定

2.3.1 光子相关光谱测定粒径的原理

2.3.2 测定方法和结果

2.4 ζ电位的测定

2.5 GO在GO-SLN中的分散状态

2.6 GO-SLN包封率的研究

2.6.1 HPLC法测定GO中DATS的含量

2.6.2 回收率和精密度试验

2.6.3 超速离心法

2.6.4 葡聚糖凝胶柱法

2.6.5 超滤法

2.6.6 冷冻絮凝过滤法

2.6.7 几种方法测定包封率的结果

2.7 纳米粒体外释药特性的研究及释药机理的初步探索

2.7.1 体外释药的测定方法

2.7.2 色谱条件

2.7.3 标准曲线的制备

2.7.4 回收率和精密度

2.7.5 稳定性试验

2.7.6 体外释放的结果

3.讨论

4.本章小结

参考文献

第四章注射用大蒜油固体脂质纳米粒指纹图谱的建立

第一节 HPLC法GO-SLN指纹图谱的建立

1.材料与仪器

2.方法与结果

2.1 色谱条件

2.2 注射用GO-SLN样品的配制

2.3 阴性对照溶液的制备

2.4 测定方法

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

2.5.2 重现性试验

2.5.3 稳定性试验

2.6 建立GO-SLN指纹图谱

第二节 GC法GO-SLN指纹图谱的建立

1.材料与仪器

2.方法与结果

2.1 色谱条件

2.2 样品溶液的配制

2.2.1 内标溶液的制备

2.2.2 注射用GO-SLN的样品制备

2.2.3 阴性对照溶液的制备

2.3 测定方法

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

2.4.2 重现性试验

2.4.3 稳定性试验

2.5 建立GC注射用大蒜油固体脂质纳米粒的指纹图谱

3.讨论

3.1 建立指纹图谱的意义

3.2 HPLC法和GC法建立指纹图谱

3.3 共有指纹峰的标定

3.4 数据处理方法

4.本章小结

参考文献

第五章 GO-SLN大鼠体内药动学与组织分布

第一节 GO-SLN和大蒜素SLN大鼠体内药动学研究

1.试药、仪器与动物

2.方法与结果

2.1 大鼠体内DATS和DADS含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

2.1.2 提取条件的优化

2.1.3 血样品的采集和处理

2.1.4 标准曲线的绘制

2.1.5 样品稳定性

2.1.6 回收率

2.1.7 精密度实验

2.1.8 方法的专属性

2.1.9 最低检测限的确定

2.2 大鼠体内药动学试验方案

2.3 药物动力学实验结果

2.3.1 GO-SLN和GO注射液药物动力学实验结果

2.3.2 GO-SLN和GO注射液药物动力学参数

2.3.3 GO-SLN和GO注射液平均血药浓度-时间曲线

2.3.4 DATS-SLN和DATS注射液药物动力学参数

2.3.5 DATS-SLN和DATS注射液平均血药浓度-时间曲线

第二节大蒜油固体脂质纳米粒组织分布研究

1.试药、仪器与动物

2.方法与结果

2.1 大鼠组织内DATS和DADS含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

2.1.2 组织样品的采集和处理

2.1.3 方法的专属性

2.1.4 标准曲线的绘制

2.1.5 方法回收率和精密度考察

2.2 组织样品测定结果

3.讨论

4.本章小结

参考文献

全文结论

致谢

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