大花金挖耳细胞培养活性物质的研究

论文摘要

大花金挖耳（Carpesium.macrocephalum Franch.et Sav）系菊科（Compositae）天名精属多年生草本植物。近代药学研究表明,该植物含有黄酮、萜内酯、甾体等多种化合物,具有清热、解毒、抗肿瘤的医疗作用和杀虫、除草及抑菌等农药活性。由于大花金挖耳生长周期长,生长受到地域和环境因素的限制,所以从大花金挖耳原植物中提取活性成分具有很大的局限性。研究利用细胞组织培养进行大花金挖耳黄酮、内酯的工业化生产是大花金挖耳研究领域的重要方向之一。自2002年以来,笔者首次进行了大花金挖耳愈伤组织诱导及愈伤组织和悬浮细胞培养活性物质的生理生化调控的系统研究,并进行了总黄酮和內酯提取工艺的研究，同时对大花金挖耳组织、细胞培养物的生物活性进行了除草、杀菌活性的初步测试。主要内容如下:1.诱导、筛选并建立了大花金挖耳黄酮0.72%和内酯0.056%含量（培养40d）的愈伤组织无性系RC,优化了RC培养条件,考察了RC愈伤组织无性系的生长和生物合成活性物质的动力特征。试验中以大花金挖耳无菌苗的幼根、下胚轴和子叶为外植体进行愈伤组织的诱导。结果表明:⑴大花金挖耳无菌苗的根是诱导愈伤组织的理想外植体;⑵适宜于诱导松散型愈伤组织的最适培养基是B5+ 2.0～3.0 mg/L NAA + 0.2～0.4 mg/L 6-BA,诱导率可达100%;⑶不同外植体愈伤组织的黄酮、内酯含量以根源愈伤组织最高;⑷B5+3.0 mg/L NAA +0.2 mg/L 6-BA （蔗糖45g/L、pH 5.7、25℃、12h/d）有利于愈伤组织的增殖;⑸根源愈伤组织在继代次数3～12代内黄酮和内酯含量较为稳定;⑹10 min紫外线照射可引起愈伤组织黄酮和内酯含量的提高;⑺MS、B5、NT及其组合培养基中,大花金挖耳愈伤组织生长量及黄酮、內酯产量随培养时间呈“S”型变化,其中NT培养基中愈伤组织的黄酮产量高于其他培养基中愈伤组织的黄酮产量,达9.50 mg/瓶,MS+NT培养基中愈伤组织的内酯产量高于其他培养基中愈伤组织的内酯产量,达0.72 mg/瓶。2.构建了大花金挖耳黄酮和内酯含量分别是1.30%、0.086%（培养20d）的细胞悬浮系及其动力学模型。在愈伤组织培养的基础上,通过培养基种类、激素、生物因子、附加物等单因子及多因子优化组合对大花金挖耳细胞培养的生理、生化调控,得到生长培养基NTB:以NT培养基为基本培养基,附加1.0 mg/L NAA、0.2 mg/L 6-BA、40 g/L蔗糖,培养液pH为5.0～6.0,培养基中添加1 mg/L B3、1～2 mg/L B1,以接种量40～50 FW g/L接种于装有100 ml的250 ml三角瓶中,置于25±2℃、光照（1500～2000 Lux）12 h/d、摇床转速120 r/min等条件下继代培养。大花金挖耳细胞生长及其黄酮和内酯形成的动力学模型的模拟结果与实验测定值基本吻合,可用于大花金挖耳细胞培养过程的动力学描述。3.初步构建了大花金挖耳细胞悬浮培养黄酮的生产培养基NTF,可得黄酮产量476.97 mg/L。通过NT培养基每个组分、附加物等单因子及多因子优化组合对大花金挖耳细胞培养的生理、生化调控,得到生产培养基NTF:大量元素NH4NO3、KNO3在NT基本培养基的基础上提高0.5倍,微量元素Na2MoO4?2H2O在NT基本培养基的基础上提高2倍,ZnSO4?7H2O、H3BO3、KI、MnSO4?4H2O、CoSO4?5H2O、CuSO4?5H2O在NT基本培养基的基础上提高1倍,附加1.0 mg/L B6,激素1.0 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA,其他培养条件同NTB。4.进行了大花金挖耳细胞培养黄酮生产培养基NTF的调优研究。以基本生产培养基NTF为基础,通过附加激素、前体、诱导子、附加物等因素对大花金挖耳细胞培养的生理、生化调控,获得了显著提高黄酮含量（2.05～2.27%）和产量（516.06～551.76 mg/L）的诱导子水杨酸及硝酸银、激素KT及GA3、前体物苯丙氨酸等几个有进一步研究价值的因素。5.进行了大花金挖耳愈伤组织、悬浮培养细胞胞内外有效成分的提取工艺研究。通过对细胞培养物的不同干燥方式、不同溶剂、不同提取方式的研究,发现大花金挖耳悬浮培养细胞的活性成分主要集中在胞内, -40℃真空冻干和60℃烘干对细胞培养物中的活性成分影响不大,培养物粉碎至40～60目,在料液比1/10～1/15的条件下,以丙酮为溶剂,摇床振荡提取1次（18 h/次）后,超声提取1次（60min/次、功率600W）即可最大量提出活性成分。6.建立了一套大花金挖耳组织、细胞培养活性成分及营养物质消耗的化学检测方法和生物活性追踪的检测方法。通过简便的紫外—可见光分光光度法检测结合对活性物质敏感的病原菌—小麦纹枯和敏感杂草—反枝苋的活性追踪,进行大花金挖耳组织、细胞培养活性物质的生理生化调控。7.对大花金挖耳果实、愈伤组织和悬浮细胞的化学成分进行预试,发现大花金挖耳果实中含有鞣质、内酯、香豆素、酚性成分、甾体、萜类、黄酮及其苷类、多糖及苷类、氨基酸以及挥发油类等类化学成分,与大花金挖耳果实相比,大花金挖耳愈伤组织和悬浮细胞中所含化学成分明显少于果实,主要含有黄酮、酯类、糖类、氨基酸、酚类。针对主要活性物质内酯类进行了GC-MS检测,发现愈伤组织和悬浮培养细胞中均有低含量的內酯类成分，说明大花金挖耳愈伤组织、悬浮培养细胞已经历了黄酮和内酯类化合物的次生代谢的生物合成过程,这为进一步优化调控,增加产量,直至大花金挖耳细胞培养活性物质的工业化生产成为可能。8.初步研究了大花金挖耳细胞培养物对16种病原菌和6种杂草和3种作物种子的生物活性。发现大花金挖耳细胞培养物的工业酒精粗提物及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等萃取物均对供试病菌和杂草具有一定程度的活性。其中乙酸乙酯萃取物除草活性最高,对反枝苋和紫花苜蓿的EC50分别为0.2945和0.1673 mg/mL,是天明精內酯酮的0.29和0.13倍;石油醚--乙酸乙酯萃取相抑菌活性最高,在10 mg/mL时,对小麦纹枯病、番茄早疫病菌、辣椒疫霉病菌、南瓜枯萎病菌供试菌抑制率均在95%以上,EC50为0.24～3.56 mg/mL。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物的次生代谢及其产物的应用
• 1.1.1 植物的初生代谢和次生代谢
• 1.1.2 植物次生代谢产物的生物学意义
• 1.1.3 植物次生代谢产物的主要类型及其合成代谢调控
• 1.1.4 植物次生代谢产物的应用
• 1.2 植物次生代谢产物的开发途径
• 1.2.1 从天然植物中直接提取次生代谢物
• 1.2.2 利用植物遗传多样性开发次生代谢物
• 1.2.3 利用分子生物学手段生产次生代谢产物
• 1.2.4 利用植物细胞工程获得次生代谢产物
• 1.3 植物细胞培养技术在植物源农药生产中的应用
• 1.4 菊科植物生物活性的研究现状
• 1.4.1 菊科植物的种类、分布及化学成分
• 1.4.2 菊科植物的医疗、保健、食用等作用
• 1.4.3 菊科植物的杀虫作用
• 1.4.4 菊科植物的杀菌、除草等作用
• 1.4.5 菊科植物资源的进一步开发利用与展望
• 1.5 大花金挖耳研究概况
• 1.5.1 大花金挖耳形态学特征及地理分布
• 1.5.2 大花金挖耳化学成分
• 1.5.3 大花金挖耳的活性研究
• 1.6 存在问题与论文设计思路
• 第二章 大花金挖耳高黄酮和内酯含量愈伤组织的诱导与培养
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 大花金挖耳无菌苗及外植体的获取
• 2.2.2 大花金挖耳愈伤组织诱导的研究
• 2.2.3 大花金挖耳愈伤组织生长的研究
• 2.2.4 大花金挖耳愈伤组织次生代谢产物的研究
• 2.3 小结与讨论
• 2.3.1 不同的消毒剂与处理时间对试验材料消毒效果的影响
• 2.3.2 正交设计在大花金挖耳愈伤组织诱导中的应用
• 2.3.3 不同培养基对大花金挖耳愈伤组织诱导的影响
• 2.3.4 不同激素及其浓度配比对大花金挖耳愈伤组织诱导的影响
• 2.3.5 紫外线照射与愈伤组织生长和次生代谢的关系
• 2.3.6 组织来源与大花金挖耳愈伤组织及活性物质形成的关系
• 第三章 大花金挖耳细胞悬浮培养体系的建立及细胞生产活性物质的生理生化调控
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 大花金挖耳细胞悬浮培养系的初步建立
• 3.2.2 大花金挖耳细胞悬浮培养系的初步优化
• 3.2.3 培养基及其组分对大花金挖耳细胞培养活性物质的生理生化调控
• 3.2.4 生物因子对大花金挖耳细胞悬浮培养生成活性物质的生理生化调控
• 3.2.5 环境条件对大花金挖耳细胞培养活性物质的生理生化调控
• 3.2.6 大花金挖耳悬浮培养细胞的动力特征研究
• 3.2.7 大花金挖耳悬浮培养细胞的形态观察
• 3.2.8 大花金挖耳悬浮培养细胞动力学模型的建立
• 3.2.9 大花金挖耳细胞培养活性物质生产培养基的初步研究
• 3.2.10 大花金挖耳细胞培养活性物质生产培养基的调优
• 3.3 小结与讨论
• 3.3.1 提高大花金挖耳细胞培养次生代谢产物的条件
• 3.3.2 提高大花金挖耳细胞培养次生代谢产物的方法
• 3.3.3 大花金挖耳细胞生长与次生代谢产物含量关系
• 3.3.4 大花金挖耳细胞培养过程动力学特征及其模型
• 第四章 大花金挖耳细胞培养物中活性物质的提取
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同提取溶剂对大花金挖耳培养物活性物质提取效果的影响
• 4.2.2 大花金挖耳培养物胞内外活性物质含量的比较
• 4.2.3 不同干燥方法对大花金挖耳细胞培养物活性物质的影响
• 4.2.4 摇床振荡提取对活性物质提取效果的影响
• 4.2.5 超声波联合摇床振荡优化提取对细胞培养物质提取效果的影响
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 大花金挖耳细胞培养物中活性物质的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试植物样品
• 5.1.2 供试种子
• 5.1.3 供试菌种
• 5.1.4 实验仪器及试剂
• 5.1.5 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 大花金挖耳果实及培养细胞粗提物的化学成分预试
• 5.2.2 大花金挖耳细胞培养物主要化学成分的GC-MS 检测
• 5.2.3 可见光分光光度法测定大花金挖耳总黄酮
• 5.2.4 紫外光分光光度法测定大花金挖耳总黄酮
• 5.2.5 紫外光分光光度法测定大花金挖耳总内酯
• 3^-、NH₄⁺、PO₄³⁺的测定'>5.2.6 大花金挖耳培养液中总糖、还原糖、NO₃^-、NH₄⁺、PO₄³⁺的测定
• 5.2.7 大花金挖耳细胞培养物的初步分离
• 5.2.8 大花金挖耳培养细胞萃取物活性物质含量的测定
• 5.2.9 大花金挖耳细胞培养物的除草活性研究
• 5.2.9.1 大花金挖耳培养细胞粗提物的除草活性
• 5.2.9.2 大花金挖耳培养细胞粗提物的不同萃取物除草活性
• 5.2.10 大花金挖耳培养细胞培养物的抑菌活性研究
• 第六章 总结
• 6.1 结论
• 6.1.1 大花金挖耳高活性愈伤组织的诱导与培养
• 6.1.2 大花金挖耳高产活性物质悬浮系的建立及其生理生化调控
• 6.1.3 大花金挖耳细胞培养活性物质的提取
• 6.1.4 大花金挖耳细胞培养中活性物质检测及营养物质测定方法的建立
• 6.1.5 大花金挖耳细胞培养中活性物质的除草和抑菌活性测定
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介