心肌细胞自噬及中药作用研究

论文摘要

自噬（Autophagy）是发生在真核细胞中由细胞初级溶酶体处理内容性底物的重要生理过程，在机体稳定、生物合成、细胞发育、组织重塑、环境适应、疾病防治、延缓衰老等方面均具有不可忽视的意义。近年来，自噬以其巨大研究及应用潜质引起医学、生物学界的广泛关注，但自噬发生机制仍未明确，自噬的中药作用研究也未见报道。本课题在相关文献指导下，以体外培养的原代乳鼠心肌细胞为实验对象，以免疫荧光组化染色技术与免疫蛋白印迹技术（Western Blot）为研究手段，以自噬特异性蛋白Beclin1与微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）为考察指标，围绕自噬模型建立、药物对自噬影响、自噬与细胞损伤相关性三部分内容，逐层深入探讨了心肌细胞自噬及其中药作用。各部分研究摘要如下：第一部分心肌细胞自噬模型建立与自噬时间相关研究本实验旨在建立可行的细胞自噬研究模型，并探讨自噬强度与自噬诱导时间关系。原代培养的乳鼠心肌细胞，设立富营养环境培养的正常对照组（CM组）和分别在指定时间窗内置于无糖无血清（glucose deprive，GD）环境培养的五个自噬模型组：GD3h、GD6h、GD12h、GD18h、GD24h组；采用免疫荧光组化染色技术和Western Blot技术分析组间自噬特异性蛋白表达差异，结果如下：1.各GD模型组较CM组，自噬特异性蛋白Beclin1、LC3II表达增多，而LC3I增加幅度相对较小，LC3II/LC3I升高；提示GD环境下自噬泡数量增加，细胞自噬被诱导。2.各组细胞间Beclin1表达与LC3II/LC3I变化趋势同为GD3h组>GD6h组>GD24h组>GD12h组>GD18h组>CM组，此即自噬强度排序。3.自噬诱导初始阶段自噬发生强烈；随诱导时间延长，自噬强度先逐渐减弱；后又有所增强。结果表明：1.心肌细胞自噬模型成功建立。2.自噬强度与GD持续时间呈非线性相关。3.提示：细胞自噬增强是应对细胞损伤的一种反应，推测细胞自噬在损伤及修复的过程中发挥重要的作用。4.在此基础上选取自噬较强的GD3h、GD6h、GD24h模型组进行下一步研究。第二部分人参皂苷Rg1、Rb1、Re对心肌细胞自噬的作用研究实验一人参皂苷Rg1、Rb1、Re的给药浓度研究本实验旨在考察人参皂苷Rg1、Rb1、Re对乳鼠心肌细胞活力影响，指导实验二给药浓度设定。原代培养的乳鼠心肌细胞，分别给予浓度0.1、1、10、100、1000μmol/L的人参皂苷Rg1、Rb1、Re作用24h，MTT法测定各组OD值，检验各给药组与对照组间差异。结果显示：只有浓度1000μmol/L的人参皂苷Rg1、Re给药组OD值的与对照组存在显著差异（P<0.01）。结果表明：除人参皂苷Rg1、Re在浓度1000μmol/L以上对心肌细胞损伤较重外，其余各药各浓度对心肌细胞活力影响不明显。参考相关文献药物常用浓度，本实验确定以人参皂苷Rg1、Rb1、Re 100μmol/L、10μmol/L作为高低剂量，考察药物对心肌细胞自噬的影响。实验二人参皂苷Rg1、Rb1、Re对心肌细胞自噬的影响本实验旨在研究药物对细胞自噬的作用，并建立细胞自噬与细胞损伤相关性的研究基础。实验分为正常对照组（CM组）；GD3h、GD6h、GD24h模型组及其相应同步高低剂量给药组，考察人参皂苷Rg1、Rb1、Re在设定浓度100μmol/L、10μmol/L下对心肌细胞自噬的影响。采用免疫荧光组化染色技术和Western Blot技术分析组间自噬特异性蛋白表达差异，结果如下：与GD模型组对比，给药组Beclin 1表达明显下降，降幅与给药剂量呈正相关。与GD模型组对比，给药组LC3I变化相对较小，LC3II表达及LC3II/LC3I明显下降，降幅与给药剂量呈正相关。结果表明：人参皂苷Rg1、Rb1、Re对细胞自噬有抑制作用，作用强度与给药剂量呈正相关，作用机制与阻止自噬泡形成相关。在此基础上，进行细胞自噬与细胞损伤相关性研究。第三部分细胞自噬与细胞损伤的相关性研究本实验旨在考察各GD模型组及相应同步给药组的细胞损伤情况、研究细胞自噬与损伤关系。实验分组同第一部分实验二。收集各组细胞培养上清液，测定LDH浓度。结果显示：1.与对照组比较,各模型组LDH浓度显著上升（P<0.01）。2.各模型组间LDH浓度排序为GD24h组>GD6h组>GD3h组。3.同时间窗给药组与模型组对比,LDH浓度下降;以GD6h、GD24h高低剂量给药组差异显著（P<0.01）。4.同时间窗给药组之间,LDH降低幅度与给药剂量呈正相关。结果表明:1.在选定时间窗内自噬发生强度与细胞损伤程度呈负相关。2.人参皂苷Rg1、Rb1、Re在有效抑制LDH释放的同时,抑制自噬发生;两种抑制作用均与药物浓度呈依赖关系。3.人参皂苷Rg1、Rb1、Re对心肌细胞有保护作用,其保护机制与促进自噬无关。因实验尚未涉及自噬特异性调节因子研究,不能判断细胞自噬与细胞损伤确切关系,推测（1）选定时间窗内细胞自噬的保护与损伤作用同时存在,以保护作用为主;（2）人参皂苷Rg1、Rb1、Re通过对抗自噬的细胞损伤作用调节自噬。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 综述：细胞自噬的研究及进展
• 前言
• 技术路线图
• 第一部分 心肌细胞自噬模型建立与自噬时间相关研究
• 实验材料与仪器
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 人参皂苷R91、R61、Re对心肌细胞自噬的作用研究
• 实验一 人参皂苷 R91、R61、Re 的给药浓度研究
• 实验材料与仪器
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 实验二 人参皂苷R91、R61、Re对心肌细胞自噬的影响
• 实验材料与仪器
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 细胞自噬与细胞损伤的相关性研究
• 实验材料与仪器
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历