论文摘要
目的:构建含有Furin识别序列和核定位信号的抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达、纯化后,对纯化产物的结合活性和内化活性进行研究。方法:设计引物扩增抗HER2单链抗体e23sFv基因,与轻链恒定区编码序列（Ck）连接成ScFv/Ck片段;人工合成含Furin识别序列（FCS）、鱼精蛋白截短体（tP）和核定位信号（NLS）的基因序列,为避免可能存在的空间位阻,各序列之间以G4S连接肽隔开,将合成的序列连接于ScFv/Ck末端,构建成ScFv/Ck/FCS/G4S/tP/G4S/NLS融合基因,在此基础上还构建了ScFv/Ck/FCS/G4S/tP、ScFv/Ck/tP/G4S/NLS、ScFv/Ck/tP、ScFv/Ck融合基因,将其克隆入原核表达载体pET28a和pET32a,在大肠杆菌BL21（DE3）LysS中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化。细胞ELISA分析融合蛋白的抗原结合活性,凝胶迁移阻滞实验检测融合蛋白与DNA的结合活性,间接免疫荧光检测融合蛋白的内化活性。结果:经酶切鉴定及测序证实:扩增的目的基因序列正确,成功构建了含有Furin识别序列和核定位信号的抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白原核表达载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）LysS用IPTG原核诱导表达,SDS-PAGE证实五种融合蛋白成功表达,并且利用Ni-NTA螯合层析介质使之得到有效纯化。细胞ELISA检测证实五种融合蛋白均具有HER2结合活性,凝胶迁移实验结果提示含tP的融合蛋白具有DNA结合活性。间接免疫荧光检测提示五种融合蛋白均可内化入HER2表达阳性的细胞,而不能内化入HER2表达阴性的细胞。同时含有Furin识别序列和核定位信号的融合蛋白ScFv/Ck/FCS/G4S/tP/G4S/NLS的内化活性优于其他四种融合蛋白。结论:ScFv与Ck、Furin识别序列、tP、NLS融合后,同时具有抗原和DNA结合活性,并且能够特异地内化入HER2表达阳性的细胞,Furin识别序列和NLS的融合能够增强这种内化作用,为该ScFv用于靶向输送DNA或siRNA的研究奠定了基础。
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