论文摘要
背景和目的丙型肝炎病毒（HCV）属黄病毒科，主要经血传播的肝炎病毒。可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，对人类健康危害极大。目前世界上有1.7亿人感染。病毒主要感染肝细胞，然而有研究表明丙型肝炎病毒也可能感染其他类型的细胞，比如B细胞，单核巨噬细胞，和树突状细胞，从而导致免疫功能异常。了解HCV作用于肝细胞和肝外细胞的分子生物学基础对揭示丙肝的发病和慢性化机制非常关键。HCV基因组转录翻译为一条多肽前体，在信号肽酶和蛋白酶的作用下裂解为10个蛋白，包括Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS5A是非结构蛋白的一种（HCV-1b型有447个氨基酸残基），C-末端丝氨酸被磷酸化后形成基础磷酸化的NS5A蛋白。在NS4A蛋白依赖的模式下，NS5A蛋白中央的丝氨酸被磷酸化，形成高度磷酸化的NS5A蛋白。NS4A蛋白结合并支配NS5A蛋白的高度磷酸化。尽管NS5A在病毒复制中的作用还未搞清，然而却发现NS5A上的一段区域（氨基酸2209到2248）与干扰素治疗的敏感性有关。此区已命名为干扰素（IFN，interferon）敏感决定区（ISDR）。对判断干扰素的疗效很有帮助。另一方面，NS5A蛋白可和PKR催化结构域直接相互作用，抑制其活性。在体内，NS5A蛋白可破坏双链RNA激活的蛋白激酶（double-stranded RNA-activated protein kinase PKR）的二级结构。抑制PKR介导的eIFalpha磷酸化。但NS5A蛋白是否参与了感染细胞抵抗IFN的抗病毒效应仍未明了。研究表明，缺失N-末段129-146氨基酸残基的NS5A蛋白有较强的反式激活作用。NSSA的转录激活区域包括两个酸性氨基酸区（2 143-2 184 2 220-2 273氨基酸残基）和一个脯氨酸富集区（2 282-2 327氨基酸残基），这些区域被认为是NS5A的转录活性区域。对NS5A进行研究，找出NS5A在肝细胞中的表达对肝细胞基因表达谱产生的影响，并进一步弄清具体作用机制、作用效应及连带影响，对明确HCV的致病机制，寻找有效防治方法具有重要意义。方法1．根据文献[6]及NCBI的Genbank上公布的HCV-1b型基因序列，设计PCR产物片段包含NS5A的特异性引物，以从病人血清中提取的以HCV-1b型RNA为模板，，利用RT-PCR方法扩增出1632bp片段，连接至pGEM-T载体并送测序，根据测序结果设计PCR产物为NS5A的特异性引物，以上述连接至pGEM-T载体1632bp片段为模板扩增出1341bp片段，连接至pGEM-T载体并送测序。2．将上述引入酶切位点EcoRV和HindⅢ的pGEM-T-NS5A和pET32a（+）空质粒经EcoRV和HindⅢ双酶切，酶切片段回收后连接，测序正确后转化BL21宿主菌，0.5mM／ml IPTG、30℃诱导5hr，3．根据1的测序结果设计NS5A缺失突变型1特异性引物，引入酶切位点KpnⅠ和HindⅢ，以pGEM-T-NS5A质粒为模板，PCR扩增出591bp片段，插入至真核表达载体pcDNA3。1（-）／myc中，测序完全正确，表明NS5A缺失突变型1真核表达载体的构建成功。4．用3构建的pcDNA3。1／myc-His（-）A-NS5ADM1真核表达重组质粒，与空质粒分别转染HepG2细胞并获得表达，两者互为平行对照，提取转染后的细胞总RNA，应用基因表达谱芯片技术检测HepG2在NS5A缺失突变体转染后差异表达的基因谱的变化。结果1．NS5A测序结果和NCBI上NS5A序列比对后，有91.4％的同源性，表明NS5A已克隆成功。2．Western blotting检测结果显示我们获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达。3．NS5A缺失突变型测序结果表明NS5A已克隆成功。4．筛选获得了3条已知的反式上调基因，10条已知的反式下调基因。结论1．成功克隆了NS5A基因，NS5A成功表达为今后单抗和多抗的制备奠定了基础。2．NS5A缺失突变体上调基因为①．细胞质膜钙离子转运ATP酶2；②．引发酶多肽；③．环指蛋白185。下调基因包括①Hbrm基因；②SCL／TAL1阻断基因座；③核糖核苷二磷酸还原酶M2链相似蛋白；④锌指蛋白253；⑤白介素2增强结合因子（ILF2）；⑥U2相关SR40蛋白；⑦神经母细胞瘤扩增蛋白；⑧酸性钙通道；⑨大电导钙激活钾通道；⑩ralA结合蛋白1（RALBP1）等。结果提示NS5Adm1与DNA和RNA复制合成过程、离子通道蛋白，肿瘤细胞的形成和细胞凋亡有关。3．上述研究为进一步开展NS5A的生物学活性研究奠定了物质基础，以及为研究其在体内存在的调控机制提供了线索和依据。