论文摘要
由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight）是世界性的重要病害,严重影响了各个国家的小麦种植与生产。在我国,小麦赤霉病常发生于长江中下游地区、华南冬麦区及黑龙江春麦区等小麦主产区,对我国的粮食生产造成了极大影响。赤霉病不仅影响小麦的生长和发育,造成严重减产,同时其产生的毒素也极大降低了小麦品质,并对人畜健康造成重大影响。自然界小麦赤霉病抗性资源严重匮乏,抗病育种工作进展缓慢,目前仍然主要采用化学防治,长期施用杀菌剂所形成的抗药性不容忽视。研究禾谷镰刀菌侵染小麦的过程与机理,分析参与该过程的关键基因和蛋白,为人们找到小麦赤霉病新的防控方法提供理论依据和基础显得尤为重要和迫切。在本研究中,我们以长江中下游禾谷镰刀菌优势菌株5035为研究材料,采用限制性内切酶介导法构建其随机插入突变体库,并对其进行鉴定和筛选研究,主要结果如下：1.所构建的REMI突变体库具有较好的单拷贝插入频率和多样性,外源DNA片段随机插入到禾谷镰刀菌不同染色体上,并倾向于插入到基因内序列,这有助于我们从突变体库中筛选获得重要突变体；2.经培养观察和致病力鉴定,我们从禾谷镰刀菌REMI突变体库中筛选获得47株重要突变体,其中36株菌丝生长明显异常,另外11株突变体致病力大幅降低；3.在所获得的47株突变体中,我们着重对M594进行了深入研究。通过TAIL-PCR获得突变体M594中的插入位点和突变基因后,对其基因和蛋白序列进行分析比对发现,突变体M594中FG07919基因发生了突变,该基因与酵母和动物中二型肌球蛋白同源,因而将其命名为Myo2基因；4.构建同源敲除载体将禾谷镰刀菌野生型菌株5035中Myo2基因进行敲除,更进一步验证了该基因缺失后所产生的影响。Myo2基因缺失后,禾谷镰刀菌胞质分裂过程发生严重异常,隔膜形成过程受阻,进而菌丝生长速率极大降低,同时其产孢能力极大下降,分生孢子畸形,串生。此外,其有性生长受到完全抑制,无法形成子囊壳和子囊孢子。更为重要的是,Myo2基因缺失后,禾谷镰刀菌完全丧失其侵染能力,毒素水平也极显著降低；5.Myo2基因缺失后,禾谷镰刀菌隔膜异常,数量下降且常不完整,透射电镜观察也证实了这些现象；6.通过将绿色荧光蛋白与Myo2蛋白进行融合,我们成功在荧光显微镜下观察到了Myo2蛋白在细胞中的位置和作用过程,并对此过程进行了动态记录。观察发现,Myo2蛋白在隔膜形成之前便聚集到分裂处,并形成环状结构,随后Myo2蛋白环收缩,同时隔膜由外自内开始形成,当Myo2蛋白环收缩成一个亮点时,隔膜形成过程结束,随后Myo2蛋白逐渐消失。Myo2蛋白在分生孢子隔膜形成中的作用过程与菌丝中相似；7.通过分析Δmyo2突变体中的基因表达谱,我们发现Myo2基因缺失后,禾谷镰刀菌次生代谢发生明显异常,参与黄色镰刀菌素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的基因表达受到抑制,这一结果也解释了Δmyo2突变体中毒素水平下降的原因。此外,我们从中还发现了一个参与真菌与植物特异性系统应答反应过程的基因FGSG00051,该基因在Δmyo2突变体中几乎无法检测到,下调水平达4万倍。该基因表达量的急剧下降也解释了Δmyo2突变体致病力的缺失；8.真菌细胞胞质分裂过程非常保守且完全不同于植物细胞,对该过程中关键蛋白作用的研究将有助于我们找到防治小麦赤霉病的新靶标。本课题中所研究的Myo2基因并不存在于植物细胞中,因而本研究为新型杀菌剂的研究提供了新的作用靶标。同时,由于Myo2蛋白及其作用在真菌中的保守性,基于其所开发的新型杀菌剂将具有很好的广谱性。本研究对实验室构建的禾谷镰刀菌长江中下游优势菌株5035随机插入突变体库进行了鉴定和筛选,从中获得了大量重要的突变体,为我们进一步研究禾谷镰刀菌发育、致病和产毒过程提供了宝贵的材料,为后续工作打下了坚实基础。对M594突变体进行深入研究发现Myo2蛋白在禾谷镰刀菌发育、致病和产毒等生物过程中发挥了关键作用。我们的研究证实了该蛋白作为防治植物真菌性病害作用靶标的可行性,对作物病害防控具有十分重要的意义。
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标签：禾谷镰刀菌论文; 限制性内切酶介导转化论文; 二型肌球蛋白论文; 隔膜论文; 胞质分裂论文;