植物人工微RNA（amiRNA）表达载体构建的方法学研究及其应用

论文摘要

人工微RNA （artificial microRNA, amiRNA）是在天然miRNA前体序列的基础上,按要求替换其中的miRNA及其互补区域,然后在生物体内按照miRNA的生物合成途径而形成的外源小RNA分子。amiRNA的高效、高特异性以及无离靶效应的优点已经在多种植物中被证实,并被公认为是继hpRNAi技术之后的第二代植物基因功能研究工具。尽管如此,由于amiRNA前体结构的特殊性,人们构建amiRNA表达载体均过程繁琐且费用昂贵。为了解决这一问题,让amiRNA技术在植物研究中应用更加广泛,本研究建立了三种新颖、简单、高效、低成本、高通量的植物amiRNA表达载体构建技术：1.基于一步PCR的无酶克隆和MAGIC的amiRNA表达载体构建技术首先通过本室创建的无酶克隆载体构建技术,构建了三个含有相应amiRNA表达单元的供体质粒pDonor-amiR319aFLC1、pDonor-amiR159aPDS和pDonor-amiR164aE1N2,然后通过接合辅助的遗传整合克隆（mating-assisted genetically integrated cloning, MAGIC）方法将amiRNA表达单元分别转移至植物双元表达载体,获得三个amiRNA表达载体p1301- amiR319aFLC1、p1301-amiR159aPDS和p1301-amiR164aEIN2。将三种amiRNA表达载体分别转入拟南芥,T1代阳性苗均出现了与预期一致的表型；Real-time PCR分析表明,转基因拟南芥中的flc1和ein2基因的表达量明显下降；同位素32P标记示踪也检测到了转基因拟南芥中amiR319aFLC1和amiR164aEIN2的存在。我们利用该方法构建了油菜amiRNA表达载体180多个,成本大大低于现有的amiRNA载体构建技术,测序结果分析表明,该方法获得amiRNA表达单元的一次性成功率在70%以上。2.基于lacO重构的蓝白斑筛选和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术首先通过重构lacO（共20bp）的方式,将携带7bp lacO序列的amiR319aCHS前体克隆至末端含有13bp lacO序列的载体pD319a-gfp （T）;然后通过直观快捷的蓝白斑筛选方式,获得含有供体质粒pD（T）-miR319aCHS的蓝色重组子；接下来通过MAGIC方法将amiR319aCHS表达单元转移至植物双元表达载体,获得amiRNA表达载体p1301 （T）-miR319aCHS。将amiR319aCHS表达载体分别转入拟南芥,T1代阳性种子出现了与预期一致的表型；Real-time PCR分析表明,转基因拟南芥中的chs基因的表达量不同程度地下降。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体40多个,对amiRNA表达单元测序分析表明,该方法获得amiRNA表达单元的一次性成功率在90%以上。3.基于多引物直接退火的植物amiRNA表达载体构建方法首先按照预先设计好的miR528PDS, miR528SpⅢ和miR528EuiI的前体序列,设计并合成三组长度为40～50nt的引物（8条/组）,每组引物各自退火；经改造获得的表达载体pYH1301-gfp)经HindⅢ&Nco I双酶切、T4 DNA聚合酶外切处理,然后与上述退火产物分别混合,直接转入大肠杆菌,获得amiRNA表达载体pYH1301-miR528PDS, pYH1301-miR528SpⅢ和pYH1301-miR528Euil。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体20个,测序结果表明,该方法获得amiRNA表达单元的一次性成功率为100%。这是目前为止所有已知的植物amiRNA表达载体构建方法中,操作最简单、成本最低廉、效率最高的一种。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 前言
• 1.1 小RNA（Small RNA）概述
• 1.1.1 miRNA
• 1.1.1.1 miRNA的发现
• 1.1.1.2 miRNA的生物合成
• 1.1.1.3 miRNA的作用机理
• 1.1.1.4 miRNA的功能
• 1.1.2 siRNA （short interfering RNA）
• 1.1.2.1 ta-siRNA
• 1.1.2.2 Repeat-associated siRNA （ra-siRNA）
• 1.1.2.3 nat-siRNA
• 1.1.2.4 外源siRNA（short interfering RNA）
• 1.2 植物人工微RNA（artificial microRNA,amiRNA）干扰技术
• 1.2.1 植物RNAi技术的种类
• 1.2.1.1 反义RNA技术
• 1.2.1.2 病毒诱导的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing,VIGS）
• 1.2.1.3 发夹RNA干扰（Hairpin RNA Interference,hpRNAi）技术
• 1.2.2 amiRNA的特点与设计方法
• 1.2.2.1 amiRNA的特点
• 1.2.2.2 amiRNA的设计方法
• 1.2.3 amiRNA基因及其表达载体的构建方法
• 1.2.3.1 amiRNA基因的构建
• 1.2.3.2 amiRNA表达载体的构建方法
• 1.2.4 amiRNA干扰技术在植物中的应用
• 1.2.4.1 植物抗病毒研究
• 1.2.4.2 基因功能研究
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 酶和主要试剂
• 2.1.5 主要缓冲液
• 2.1.6 引物序列
• 2.2 方法
• 2.2.1 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4 大肠杆菌的转化
• 2.2.5 农杆菌的转化
• 2.2.6 无酶克隆方式构建载体
• 2.2.7 DNA的体外操作
• 2.2.7.1 DNA的限制性内切酶的酶切、体外的连接
• 4 DNA聚合酶处理线性DNA分子'>2.2.7.2 T₄DNA聚合酶处理线性DNA分子
• 2.2.8 MAGIC方法构建植物amiRNA双元表达载体
• 2.2.9 培养基种植拟南芥
• 2.2.10 农杆菌介导的浸花法转化拟南芥
• 2.2.11 拟南芥总DNA的提取
• 2.2.12 拟南芥总RNA的提取
• 2.2.13 拼接法（splinted ligation）检测amiRNA
• 2.2.14 实时定量PCR
• 3. 结果与讨论
• 3.1 基于一步PCR的无酶克隆和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术
• 3.1.1 供体质粒pD319a-gfp、pD159a-gfp和pD164a-gfp的构建
• 3.1.2 miR319a与miR159a前体中环序列的合成
• 3.1.3 受体质粒p1301-gfp的构建
• 3.1.4 amiRNA双元表达载体的获得
• 3.1.5 amiRNA在拟南芥中的表达及干扰效果鉴定
• 3.1.6 小结与讨论
• 3.1.6.1 供体载体与受体载体的改造
• 3.1.6.2 采用无酶克隆方式获得amiRNA表达单元的效率
• 3.1.6.3 通过MAGIC方式获得amiRNA表达载体
• 3.2 基于lacO重构的蓝白斑筛选和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术
• 3.2.1 供体质粒pD319a-gfp（T）的构建
• 3.2.2 amiRNA双元表达载体的获得
• 3.2.3 特异性amiRNA在拟南芥中的表达及干扰效果鉴定
• 3.2.4 小结与讨论
• 3.3 基于多引物直接退火的植物amiRNA表达载体构建方法
• 3.3.1 表达载体pYH1301-gfp的构建
• 3.3.2 水稻amiRNA表达载体的获得
• 3.3.3 小结与讨论
• 3.4 人工ta-siRNAs（artificial ta-siRNAs,ata-siRNAs）对拟南芥内源基因的干扰效果研究
• 4. 总结与展望
• 4.1 已取得的主要研究成果
• 4.2 进一步的研究设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表的相关论文