雅安周公山苏云金芽胞杆菌基因资源研究和杀虫基因的克隆

论文摘要

本研究从四川雅安周公山原始森林土壤中采集土壤350份,应用醋酸钠-抗生素法筛选出132株苏云金芽胞杆菌菌株,出菌率为11%。初步研究发现这些苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体类型有菱形、方形、球形、无定形等,充分体现了我国菌株资源的多样性。因此我们对雅安周公山苏云金芽胞杆菌基因资源进行了初步的研究和部分杀虫基因的克隆,主要结果如下:1、通过对采集的350份土壤的海拔、资源、气候等地理特征分析,总结出了Bt资源的分布规律:在海拔1742米下,不同海拔高度的Bt出菌率经差异显著性分析后显示其无明显差异;腐质土比黏土高、黏土又高于沙土;植被覆盖率高的地区,生态条件优越,Bt分离率高;土壤表面腐质层越厚,土壤所含腐殖质越丰富,Bt含量越多;山脉阳坡出菌率比阴坡高。2、对这132株Bt野生菌的伴孢晶体蛋白进行了SDS-PAGE分析。结果显示杀鳞翅目、鞘翅目和双翅目的杀虫蛋白带最丰富,显示了周公山Bt菌的杀虫蛋白具有一定的特异性。3、对132株Bt野生菌的cry基因进行了PCR-RFLP分析鉴定,发现含cry1型基因菌株有74株,cry2型为34株,cry7型16株,cry9型16株,cry3型13株,cry4型8株,cry30型7株,cry8型2株,cry40型2株,另外有46株菌含未知基因,占34.8%。结果显示cry1基因含量最丰富,cry2基因其次,cry9和cry3基因第三。4、克隆了cry9Ea4基因（Accession number:EU760456）。该基因的核苷酸序列为3468bp,与已报道的cry9Ea序列同源性高达99%。经国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry9Ea4。5、对132株Bt野生菌vip3基因进行了PCR分析鉴定,发现有25株菌含Vip3A基因,出菌率为19%;另外有4株菌含新Vip3基因。6、克隆了vip3A基因的部分序列。7、对菌株ZG5-4、HY3-2进行了菌种鉴定:ZG5-4定名为苏云金芽胞杆菌腊螟变种（Bacillus thingiensis var galleriae）;HY3-2菌株定名为苏云金芽胞杆菌杀虫变种（Bacillus thringiensis var entomocidus）。8、对菌株ZG5-4和菌株HY3-2进行了抗虫生物活性测定。结果表明菌株ZG5-4对鳞翅目的甜菜夜蛾、棉玲虫初孵幼虫有毒力,LC50分别为23.42 ng/mL和13.24ng/mL,而菌株HY3-2对甜菜夜蛾、棉玲虫初孵幼虫的LC50分别为21.17ng/mL和14.07ng/mL。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.文献综述
• 1.1 苏云金芽胞杆菌概述
• 1.2 苏云金芽胞杆菌的血清型分类
• 1.3 杀虫晶体蛋白（ICPS）
• 1.4 苏云金芽胞杆菌VIPs
• 1.5 农业害虫甜菜夜蛾和棉铃虫
• 1.6 开题设想
• 2.材料与方法
• 2.1 材料及培养基
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 PCR扩增用引物
• 2.1.3 供试害虫
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 限制性内切酶和其它酶类
• 2.1.6 缓冲液
• 2.1.6.1 碱法提取质粒DNA所用缓冲液
• 2.1.6.2 DNA电泳缓冲液
• 2.1.6.3 DNA片断回收所用缓冲液
• 2.1.6.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
• 2.1.6.5 其它试剂和溶液
• 2.1.6.7 数据处理
• 2.1.6.8 cry1,cly2,cry9及cry1I基因的PCR-RFLP鉴定体系
• 2.1.6.9 Vip3A基因的PCR鉴定
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株的分离
• 2.2.1.1 土样采集方法
• 2.2.1.2 醋酸钠-抗生素分离法
• 2.2.2 PCR扩增反应体系
• 2.2.3 热循环反应
• 2.2.4 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE
• 2.2.4.1 杀虫晶体蛋白提纯
• 2.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
• 2.2.5.1 试剂
• 2.2.5.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
• 2.2.5.3 用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
• 2.2.6 cry9Ea4全基因和Vip3A部分基因的克隆
• 2.2.6.1 菌株及试剂
• 2.2.6.2 Bt基因组DNA的提取
• 2.2.6.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（PEG法）
• 2.2.6.4 杀虫晶体蛋白基因cry9Ea4和Vip3A的PCR
• 2.2.6.5 cry9Ea4基因、Vip3A部分基因的克隆
• 2.2.6.5.1 目的DNA片段的回收
• 2.2.6.5.2 连接反应
• 2.2.6.5.3 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.6.5.4 筛选
• 2.2.6.5.5 序列测定及分析
• 2.2.6.6 Bt质粒DNA的提取
• 2.3 活性测定
• 2.4 菌种鉴定
• 2.4.1 菌体形态特征
• 2.4.2 培养特征
• 2.4.3 生理生化特征
• 2.4.4 细胞壁化学组分分析
• 2.5 仪器设备
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株分离
• 3.2 菌株的伴孢晶体形态的多样性
• 3.3 Bt分离株SDS-PAGE
• 3.4 苏云金芽胞杆菌cry基因的鉴定
• 3.5 Bt菌株Vip3A基因的鉴定
• 3.6 菌株ZG5-4 cry9Ea4基因的克隆分析
• 3.6.1 菌株ZG5-4中cry9Ea4全长基因的克隆
• 3.6.2 cry9Ea4基因的核苷酸序列测定与分析
• 3.6.3 cry9Ea4氨基酸序列及蛋白质特性分析
• 3.7 菌株HY3-2 Vip3A基因的克隆分析
• 3.8 生测结果
• 3.9 ZG5-4、HY3-2苏云金芽胞杆菌的鉴定
• 3.9.1 形态特征、培养特征、生理生化特征
• 3.9.2 菌株鉴定结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献