CD4+CD25+调节性T细胞与疾病相关性及其体外扩增的实验研究

论文摘要

正常人体内一般都有对自身抗原产生特异性反应的T细胞存在,但由于受到各种耐受机理的严格控制而不会导致免疫性疾病的发生。CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）是自然产生并成熟于胸腺的独特细胞群,在正常人外周血和脾脏中占CD4+T细胞5%-10%。Tregs具有免疫无反应性和免疫抑制两大功能。随着对Tregs研究的深入,发现其在自身免疫病、器官移植、肿瘤免疫、慢性炎症反应、持续感染、母胎耐受等多方面发挥重要作用。本课题首先对CD4+CD25+、CD4+CD25highT细胞及其功能性转录因子Foxp3在正常人及疾病状态下（再生障碍性贫血、自身免疫病及恶性肿瘤）的表达特点进行了系统分析,结果表明:CD4+CD25+、CD4+CD25high T细胞及Foxp3在再生障碍性贫血及自身免疫病患者表达减低,而在肿瘤患者表达增高,表明Tregs与相关疾病的发生、发展密切相关。然而,其临床应用的主要限制之一为它们在人外周血和小鼠外周淋巴器官中比例低,没有足够数量用于疾病的治疗。因此我们进一步探讨了CD4+CD25+T细胞的体外分离和扩增方法,及分离和扩增后CD4+CD25+ T细胞的功能检测,结果表明:用免疫磁珠法分离正常人外周血CD4+CD25+ T细胞,可以得到很好的效果,分离的CD4+CD25+ T细胞纯度在80%以上;采用高剂量IL-2 +磁珠包被的anti-CD3mAb/anti-CD28mAb对CD4+CD25+ T细胞进行扩增,第9天增殖倍数达到68倍;分离和扩增后的CD4+CD25+ T细胞均具有免疫无反应及免疫抑制特性,并高表达Foxp3。为了解Treg细胞生长发育特点,我们采用流式细胞术及RT-PCR方法对新生儿脐血CD4+CD25+Treg细胞及Foxp3进行测定,并与正常人外周血进行比较,结果表明:脐血中Tregs的数量多,但占CD4+T细胞的百分比减低,考虑是由于脐血中CD4+T细胞比例较高的缘故,而脐血Foxp3表达减低,表明其功能还不成熟。进一步对脐血CD4+CD25+ T细胞的体外分离、功能鉴定及培养扩增的研究发现:脐血的分选及扩增结果同成人外周血相似,提示经外周抗原刺激后可以促使脐血Tregs成熟并发挥作用。本课题研究的创新性在于在国内首次应用高剂量IL-2 +磁珠包被的anti-CD3mAb/anti-CD28mAb的方法对正常人外周血及新生儿脐血CD4+CD25+ T细胞进行体外培养和扩增,取得了较好的效果,并证实扩增后的CD4+CD25+ T细胞仍具有其免疫特性,我们上述实验的研究成果进一步证明了CD4+CD25+T细胞的临床应用前景。

论文目录

• 提要
• 英文缩略词
• 前言
• +CD25^HIGH调节性T细胞及FOXP3在正常人外周血及疾病状态下的表达特点及临床意义'>第一章 CD4⁺CD25^HIGH调节性T细胞及FOXP3在正常人外周血及疾病状态下的表达特点及临床意义
• 1 材料
• 1.1 临床资料及实验分组
• 1.2 主要实验仪器和器材
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 外周血单个核细胞（PBMC）分离
• 2.2 淋巴细胞表面因子和细胞内因子免疫荧光染色
• 2.3 流式细胞检测
• 2.4 RT-PCR 检测PBMC 中Foxp3 mRNA 表达水平
• 2.5 统计学处理
• 3 结果
• 4 讨论
• +CD25⁺调节性T 细胞的分离、功能鉴定及体外培养扩增'>第二章 正常人外周血CD4⁺CD25⁺调节性T 细胞的分离、功能鉴定及体外培养扩增
• 1 材料
• 1.1 标本来源
• 1.2 主要实验仪器和器材
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 PBMC 的制备
• +CD25⁺T 细胞'>2.2 利用免疫磁珠法分选CD4⁺CD25⁺T 细胞
• 2.3 增殖抑制试验（MTT 比色试验）
• +CD25⁺ T 细胞和CD4⁺CD25⁺T 细胞的体外扩增'>2.4 CD4⁺CD25⁺ T 细胞和CD4⁺CD25⁺T 细胞的体外扩增
• 2.5 统计分析
• 3 结果
• 4 讨论
• +CD25^HIGH调节T 细胞及FOXP3 的表达特点及分离、功能鉴定及体外培养扩增'>第三章 新生儿脐血CD4⁺CD25^HIGH调节T 细胞及FOXP3 的表达特点及分离、功能鉴定及体外培养扩增
• 1 材料
• 1.1 临床资料
• 1.2 主要实验仪器和器材
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的论文
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT