RNAi抑制COX-2活性对人胃腺癌细胞系SGC-7901生长抑制的体内外研究

论文摘要

目的研究COX-2在胃腺癌组织中的表达,探讨COX-2与PCNA,PGE2,VEGF,CD31,cyclin D1在胃腺癌发生发展中作用的相互关系。构建COX-2的siRNA,检测其在胃腺癌细胞株SGC-7901中对COX-2基因表达的抑制作用,以及敲低COX-2的表达后,观察PGE2,PCNA,VEGF,CD31,cyclin D1的表达变化,以及细胞周期,增殖活性,凋亡,侵袭活性的变化,并进一步探讨COX-2在胃腺癌细胞系中的作用机制。应用COX-2 siRNA导入裸鼠胃腺癌皮下动物模型后,验证在体内COX-2 siRNA对SGC-7901胃腺癌的抑制作用。方法本课题分三部分进行:第一部分构造胃腺癌组织芯片,利用免疫组化检测COX-2,PCNA,PGE2与VEGF的蛋白表达。第二部分在体外应用RNA干涉技术以Oligofectamine介导siRNA靶向COX-2转染人胃腺癌细胞系SGC-7901后,应用realtime PCR检测目的基因的敲低情况,并用Western blot和免疫荧光技术检测了RNAi敲低COX-2的表达后,COX-2通路相关基因PCNA,PGE2,Bcl-2,Cyclin D1与VEGF的表达变化。并用MTT、annexin V标记、流式细胞术及Matrigel 3D生长实验等方法分析了转染前后细胞增殖、凋亡、细胞周期分布和侵袭能力的变化。第三部分中则通过建立裸鼠胃腺癌皮下动物模型,瘤内注射Oligofectamine和siRNA的混合物,动态观察肿瘤生长情况,检测RNA干涉技术敲低SGC-7901裸鼠胃腺癌COX-2的表达后PCNA,VEGF,CD31的表达变化;并应用TUNEL法检测细胞凋亡,对体外实验的结果进一步验证。结果1.COX-2在胃腺癌组织中过度表达（68.9%）,且随组织的恶性分化程度升高而表达增强（x2=31.855,P＜0.001）。COX-2在胃腺癌组织中的表达与癌旁组织及正常组织相比较具有差异性（x2=14.231,P=0.027）。PGE2,PCNA,VEGF（80.0%,84.4%和73.3%）也在胃腺癌组织中呈现过表达的现象,同时,COX-2,PCNA,PGE2与VEGF表达之间存在正相关性。2.realtime PCR结果提示,转染COX-2 siRNA后可明显敲低COX-2 mRNA的表达。MTT结果显示转染COX-2 siRNA后细胞增殖率与转染nonsense siRNA和对照组相比明显受抑制（P＜0.05）,通过Western blot和免疫荧光检测发现除COX-2的蛋白明显敲低外,COX-2通路相关基因PCNA,PGE2,Bcl-2,CyclinD1与VEGF的表达水平均明显降低。应用Annexin V检测发现转染COX-2siRNA组细胞凋亡率明显升高,进一步应用流式细胞术检测细胞周期分布发现S期细胞比例降低,细胞阻滞于G0/G1期。侵袭试验结果显示COX-2 siRNA可明显抑制SGC-7901细胞的侵袭。3.成功建立胃腺癌SGC-7901细胞系裸鼠皮下肿瘤模型后,每4天测量一次肿瘤体积,并在肿瘤局部多点注射siRNA和Oligofectamine混合物,发现和对照组相比,COX-2 siRNA治疗组肿瘤生长缓慢,从治疗后的第15天起,肿瘤体积出现明显差别,这种差别在观察末期（30天）最显著。应用免疫组化法检测肿瘤标本,发现COX-2的蛋白明显敲低的同时,PCNA,CD31,VEGF表达水平均明显降低。应用TUNEL法检测原位细胞凋亡发现COX-2 siRNA治疗组凋亡细胞明显增加。体内和体外实验的结果一致。结论1.COX-2,PCNA,PGE2,VEGF的表达上调与胃腺癌的分化的严重程度、发生与进展呈正相关。2.应用以Oligofectamine介导的RNA干涉技术转染siRNA靶向COX-2可有效敲低COX-2在胃腺癌SGC-7901细胞内的表达,同时抑制PCNA,PGE2,Bcl-2,Cyclin D1与VEGF的表达活性,从而抑制了细胞的增殖和侵袭,出现G0/G1期阻滞,并诱发细胞凋亡。3.裸鼠皮下胃腺癌模型应用Oligofectamine介导的COX-2 siRNA治疗,同样可有效敲低COX-2的表达,抑制肿瘤的生长,诱导细胞凋亡,与体外试验结果一致。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、COX-2在胃腺癌中的异常激活
• 1.1 材料方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、RNAi抑制COX-2活性对人胃腺癌细胞SGC-7901生长抑制的体外研究
• 2.1 材料方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、RNAi抑制COX-2活性对人胃腺癌细胞SGC-7901生长抑制的体内研究
• 3.1 材料方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• RNAi在胃癌相关基因功能研究和治疗方面的应用
• 综述参考文献
• 致谢