交链孢Alternaria sp.酸性木聚糖酶基因在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

论文摘要

木聚糖酶在造纸制浆、纺织、饲料、酿酒、果汁生产中具有广阔的应用前景。在造纸工业,木聚糖酶可以提高纸张的白度和强度,减少氯的用量,降低生产成本,减轻对环境的污染；在饲料行业,木聚糖酶可缓解木聚糖在饲料中的抗营养作用,促进双歧杆菌的繁殖,抑制腐败菌的增生,促进矿物质的吸收,增强免疫功能；在食品工业,木聚糖酶加工面包食品,可以改善面包的质地、结构和松软度。另外,木聚糖酶还可应用于酿造行业,甚至有报道木聚糖酶可以用来生产生物燃料,缓解能源紧张的问题。目前,很多木聚糖酶基因已被克隆并且实现了重组表达,并解析了其三维晶体结构。但是交链孢Alternaria sp.的木聚糖酶尚未有人研究,但作为一个植物病原菌,能侵入植物组织,一定能产生木质纤维素降解酶,本研究前期克隆了交链孢的木聚糖酶基因xyn186,是第一个从Alternaria属克隆得到的木聚糖酶基因,利用基因自身信号肽在毕赤酵母中进行异源表达,初步研究了粗酶液的性质。本实验对Alternaria sp. HB186来源的这个新木聚糖酶基因xyn186进行了序列分析。该基因含有一个696bp的开放阅读框,编码19个氨基酸的信号肽和213个氨基酸的11家族糖基水解酶。XYN186具有11家族糖基水解酶的两个高度保守的催化氨基酸残基（E106,E197）,含有两个潜在N-糖基化位点,和Aspergillus niger来源地木聚糖酶B相似度为60%,将获得的编码成熟肽的cDNA克隆进pHBM905A载体转入毕赤酵母GS115进行表达,转化子在含交联木聚糖的平板进行筛选。挑选水解圈较大的重组子进行诱导表达,表达酶液经过纯化后,进行SDS-PAGE检测,结果显示,该酶的分子量为23kDa,未被糖基化。酶学性质研究显示,该酶的最适温度是50℃,最适pH为6,在4.5-6.5有80%以上的活性,是个酸性木聚糖酶。XYN186的比酶活为81.56U·mg-1, Km和Vmax分别为1.404mg-ml-1和0.2748mmol·min-1·mg-1。酶在40℃具有良好的热稳定性,但是在50℃处理15min几乎完全丧失活性。Cu2+和Hg2+几乎完全抑制了酶的活性,其它实验的金属离子对酶的活性影响不大。通过Realtime-PCR检测到所得重组菌株整合了两个拷贝的木聚糖酶基因xyn186。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1 木聚糖酶的研究进展
• 1.1.1 木聚糖介绍
• 1.1.2 木聚糖结构
• 1.1.3 木聚糖酶复合体
• 1.1.4 木聚糖酶复合体的协同作用
• 1.1.5 嗜温和嗜热资源来源地木聚糖酶
• 1.1.6 木聚糖酶产品
• 1.1.7 木聚糖酶的应用
• 1.1.8 木聚糖酶蛋白质家族
• 1.2 毕赤酵母表达系统的研究进展
• 1.3 荧光定量PCR技术
• 1.3.1 SYBR Green Ⅰ
• 1.3.2 TaqMan探针
• 1.4 本研究的前期工作
• 1.5 本研究的目的
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料和仪器设备
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 酶和试剂
• 2.1.6 仪器和设备
• 2.1.7 主要缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌总DNA的抽提
• 2.2.2 酵母总DNA的抽提
• 2.2.3 质粒DNA的抽提
• 2.2.4 RBB木聚糖的制备
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6 大肠杆菌重组子的筛选
• 2.2.7 序列分析
• 2.2.8 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
• 2.2.9 木聚糖酶毕赤酵母表达载体的构建与验证
• 2.2.10 重组毕赤酵母在底物平板上的诱导表达
• 2.2.11 外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
• 2.2.12 木聚糖酶的纯化
• 2.2.13 酶的去糖基化处理
• 2.2.14 蛋白浓度测定
• 2.2.15 SDS-PAGE检测表达蛋白
• 2.2.16 实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数
• 2.2.17 酶解液中还原糖含量的测定（DNS法）
• 2.2.18 酶学性质测定
• 2.2.19 酶动力学常数Km、Vmax的测定
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 序列分析
• 3.2 木聚糖酶xyn186基因毕赤酵母表达质粒的构建
• 3.3 木聚糖酶xyn186基因毕赤酵母表达质粒的验证
• 3.4 重组质粒pHBM905A-xyn186向毕赤酵母的转化
• 3.5 木聚糖酶XYN186的诱导表达及纯化
• 3.6 重组木聚糖酶XYN186的去糖基化处理
• 3.7 木聚糖酶XYN186的最适温度和热敏感性
• 3.8 木聚糖酶XYN186的最适pH和pH稳定性研究
• 3.9 金属离子和化学试剂对木聚糖酶XYN186的影响
• 3.10 木聚糖酶XYN186的底物特异性研究
• 3.11 木聚糖酶XYN186的酶动力学研究
• 3.12 实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数
• 第四部分 讨论
• 参考文献
• 研究生期间参与发表的文章与专利
• 致谢