论文摘要
建鲤是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心人工培育出来的鲤鱼品种,具有多种优良的经济性状,已在全国多地进行养殖。在建鲤的遗传改良上,我们主要集中在生长这一重要的经济性状,并取了一定的成绩。但生长速度的提高最终会到达一个平台期,育种的方向必然会转向其它经济性状,因此很有必要开展摄食因子的研究,为后续的建鲤育种提供理论基础。本文主要以下从几个方面展开研究:1.建鲤最适管家基因的研究在本研究中,系统地分析建鲤的多个管家基因的表达量,确定了一个最适管家基因。克隆了建鲤常用管家基因延伸因子1α（EF-1α）,β肌动蛋白（ACTB）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体18S rRNA（18S rRNA）的部分DNA序列。分别从建鲤幼鱼和成鱼9个组织中（前脑、下丘脑、肝脏、前肠、后肠、卵巢、肌肉、肾）提取了 RNA,应用real time PCR研究了 4个管家基因在9个组织中的相对表达量。通过评价real time PCR中管家基因Ct的CV值来确定管家基因的稳定性。CV值越小,表明管家基因在各组织中表达量变化越小。结果表明,EF-1α在建鲤幼鱼和成鱼期的各组织中表达量变化最小,适合作管家基因。但在不同发育期,没有一个最适管家基因,EF-1α仅在前脑、下丘脑、肝脏、心脏和肾脏中表达量变化最小。这一结果为后续的建鲤功能基因研究中管家基因的正确选择奠定了基础,同时也表明了不同的实验条件会导致管家基因的不一致性。2.建鲤leptins的克隆及其时空表达瘦素（leptin）是肥胖基因表达的产物,在动物摄食调控中起着重要的作用。本文应用RT-PCR以及PCR法,克隆了建鲤leptins基因包含ORF的部分序列,使用realtime PCR对其不同发育期的组织表达进行了研究。结果表明建鲤leptins基因含有三个同源基因,分别为jlLEP-A1,jlLEP-A2和jlLEP-B。jlLEP-A1长741 bp,内含子序列长 93 bp,对应的开放阅读框长度为516bp,翻译成171个氨基酸,预测的蛋白质分子量为19.3 kD。jlLEP/A2长792 bp,内含子序列长102 bp,对应的开放阅读框长度为516bp,翻译成171个氨基酸,预测的蛋白质分子量为19.5 kD。jlEP-B长1194 bp,内含子序列长687bp,对应的开放阅读框长度为507bp,翻译成168个氨基酸,预测的蛋白质分子量为19.2 kD。同源性分析显示,leptin氨基酸之间相似性较低。jlLEP-A1与jlLEP-A2之间相似性为82.5%,与jlLEP-B的相似性分别为29.5%,28.8%。jlLEP-A1与鲤鱼leptin Ⅰ的相似性最高,为99.4%,与人leptin的相似性最低,为22.3%;jlLEP-A2与leptin Ⅱ相似性最高,为98.8%,与河豚leptin的相似性最低,为22.1%;jlLEP-B与斑马鱼leptin-B的相似性最高,为85.7%,与青鱂leptin-B相似性最低,为17.1%。尽管相似性不高,但jlLEP-A1,jlLEP-A2,jlLEP-B均含有2个半胱氨基酸残基,这也是脊椎动物leptin形成二硫键产生生物活性的必需基团。系统发育分析表明,鱼类leptin存在两种类型,jlLEP-A1 和 jlLEP-A2 归为一类,jlLEP-B归为另外一类。real time PCR显示,建鲤leptins在幼鱼和成鱼中的表达模式不一样,而且雌雄鱼之间也存在着差异。在幼鱼中,jlLEP-A2在各组织中的相对表达量均显著性的低于jlLEP-A1和jlLEP-B。jlLEP-A1和jlLEP-B主要在性腺（精巢、卵巢）和肝脏中表达。雌鱼中,jlLEP-A1和jlLEP-A2主要在下丘脑和肝脏中表达,jlLEP-B在各组织中的相对表达量较低,jlLEP-A1在卵巢中的相对表达量显著性的高于jlLEP-A2和jlLEP-B。在雄鱼中,jlLEP-A1在下丘脑中的相对表达量较高,其次为肝脏,jlLEP-A2在肌肉中的相对表达量较高,其次为精巢和肝脏,jlLEP-B在下丘脑中的相对表达量最高。3.建鲤NPYs的克隆及其时空表达神经肽Y（NPY）属于肽类家族,在动物摄食调控中起着重要的作用。本文应用RT-PCR以及PCR法,克隆了建鲤APYs基因包含ORF的部分序列,使用real time PCR对其不同发育期的组织表达进行了研究。结果表明建鲤NPYs基因含有二个同源基因,分别jlNPYa和jlNPYb。jlNPYa长2084bp,含有3个内含子,长度依次为316bp,897 bp,178 bp,其相位分别为0,2,2。对应的开放阅读框长度为291 bp,翻译成96个氨基酸,预测的蛋白质分子量为10.96 kD。建鲤jlNPYb长2140bp,含有3个内含子,长度依次为315bp,929bp,166bp,其相位分别为0,2,2。对应的开放阅读框长度为291bp,翻译成96个氨基酸,预测的蛋白质分子量为10.97kD。同源性分析显示,NPY氨基酸之间相似性较高。jlNPYa和jlNPYb之间相似性为97.9%。它们与人、小鼠、鸡以及其它鱼类的相似性达到60%以上,但与河豚NPYb的相似性低于60%分,别为54.3%、53.2%。NJ树显示,NPY分为两大类,jlNPYa和NPYb聚为一类,应同为NPYI。组织表达分析显示,建鲤NPYs主要在前脑、下丘脑、精巢以及肝脏中表达,在其它组织中表达量较低。在幼鱼期,下丘脑中jlNPYb的表达量显著高于jlNPYa的表达量。在成鱼期,雌雄鱼间表达模式存在较大差异。雌鱼下丘脑中,jlNPYa的表达量显著性的高于jlNPYb。但在雄鱼下丘脑中,jlNPYb的表达量显著性的高于jlNPYa。4.禁食对建鲤leptins和NPYs表达的影响建鲤禁食9天和禁食45天后,抽提雌、雄鱼的前脑、下丘脑、肝脏以及精巢RNA。应用real time PCR研究禁食对建鲤leptin和NPYs基因表达的影响。结果发现禁食过程中,建鲤leptins基因在前脑、下丘脑和肝脏各组织中表达量发生了显著性的变化,下丘脑是jlLEP-B表达量变化最大的组织,禁食使雌鱼下丘脑的jlLEP-B表达量上升,而雄鱼的表达量则下降,这表明jlLEP-B主要在下丘脑中行使功能。肝脏是jlLEP-A1和jlLEP-A2表达量变化最大的组织,禁食使雌鱼肝脏jlLEP-A1和jlLEP-A2表达量上升,雄鱼jlLEP-A1表达量上升,而jlLEP-A2表达量则下降,这表明jlLEP-A和jlLEP-A2主要在肝脏中行使功能。禁食同样引起建鲤NPYs在前脑,下丘脑、肝脏和精巢各组织中表达量发生了显著性的变化。在前脑中,禁食引起jlNPYa和jlNPYb表达量的变化最大,这暗示着建鲤NPYs主要在前脑中行使功能。禁食使雄鱼前脑jlNPYa的表达量下降,而jlNPYb的表达量上升,雌鱼NPYs的表达量均上升。在精巢中,只有jlNPYb的表达量随着禁食天数的增加而增加,这表明jlNPYb可能和鱼类生殖调控有一定关联。5.建鲤leptins的原核表达根据建鲤leptins的氨基酸序列,找出信号肽剪切位点,设计成对引物,扩增基因不含信号肽的ORF区域。将扩增产物分别连接到pET-32a（+）和pGex-4T-1原核表达载体,构建重组质粒,测序验证插入位点的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组蛋白pET-32a（+）/leptins和pGex-4T-1/leptins。结果表明在37 ℃、5 h 和 1 mmol/L IPTG 的诱导条件下,重组蛋白 pET-32a（+）/jlLEP-A1,pET-32a（+）/jlLEP-B 和 pGex-4T-l/jlLEP-A1,pGex-4T-1/jlLEP-B 表达量最大,但jlLEP-A2重组蛋白未表达。SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以可溶蛋白形式存在。这一结果为后续的建鲤体内注射重组leptin蛋白研究奠定基础。6.建鲤leptins的SNPs和生长的相关性研究比对8尾建鲤leptins的SNPs,共找到3个SNPs,均在外显子区域,分别为jlLEP-A1的 A1-T113C和jlLEP-A2的 A2-G415A、A2-G427A。应用 PCR-RFLP 的方法,检测了 557尾建鲤（雄鱼294尾,雌鱼263尾）群体的SNPs,将其与鱼种以及成鱼阶段的增重进行相关性分析。结果表明A1-T113C位点与雌鱼鱼种阶段有显著（P<0.05）和极显著相关性（P<0.01）,TC型雌鱼增重显著比TT型个体快,极显著比CC型个体快。与雌雄鱼成鱼阶段增重呈显著相关（P<0.05）,TC型雌雄鱼增重显著比TT型个体快。A2-G415A位点与雄鱼鱼种阶段增重有显著相关性（P<0.05）,AA和AG型增重显著比GG型个体快。成鱼阶段,AA和AG型增重极显著比GG型个体快（P<0.01）。A2-G427A位点与雄鱼鱼种阶段有显著性的差异（P<0.05）,AA型增重显著比GA型快。雄鱼成鱼阶段也有显著性的差异（P<0.05）,AA型增重显著比GA型快。这一研究为后续的分子标记育种奠定了基础。