H5亚型禽流感病毒的生物学特性及其基因重组疫苗株的构建

论文摘要

“97香港禽流感事件”及近年来世界范围内频繁暴发禽流感疫情并再次导致数十人感染致死充分证明,H5亚型高致病性禽流感对人类公共卫生构成了巨大的潜在威胁。本论文对我国2003年分离的1株H5N1亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/27/03的生物学特性进行了研究。首先,我们对其进行了全基因组的序列测定,并与1996—2006年的东亚地区H5N1亚型HPAI代表株基因组序列进行了比较,分子遗传衍化的分析结果表明:此毒株的HA、NA、NP和M基因与A/Goose/Guangdong/1/96高度同源,且HA基因裂解位点表现为连续的多个碱性氨基酸这一高致病性特征;而其PB2、PB1、PA、NS基因与A/Goose/Guangdong/1/96的亲缘关系相对较远。其次,通过此毒株对鸡的致病性试验发现:本毒株EID50为10-8.38/ml,感染鸡的静脉接种指数IVPI为3.00、鸡静脉接种的平均死亡时间MDT为1天,故可判断此毒株为高致病性禽流感病毒。为进一步了解此毒株是否具有感染哺乳动物的能力,我们将上述病毒经鼻腔感染哺乳动物模型BALB/c小鼠,研究结果显示,本病毒MLD50为100.63EID50,对小鼠也呈现了高致病力,而从其感染小鼠的组织嗜性试验结果来看,病毒经鼻腔接种感染小鼠后,其在肺脏中一直保持较高的含量;在脾中病毒的含量次之,而且在肺和脾中病毒含量随时间的增加有所下降;在脑和肾脏也可分离到病毒但含量不高。综合以上结果表明,此株对禽类表现为高致病性的H5N1亚型禽流感病毒具有感染并致死哺乳动物模型BALB/c小鼠的能力。H5N1亚型高致病性禽流感的爆发给世界养禽业造成了毁灭性的打击,而疫苗免疫是防止其发生的重要手段。本研究利用反向遗传操作技术人工救获了H5N2亚型重组流感病毒疫苗株,两个表面抗原基因HA和NA来源于A/Tuekey/England/N28/73,而其内部基因来源于高滴度鸡胚适应株A/Puerto Rico/8/34。本疫苗株的成功构建为进一步防控我国禽流感的发生奠定了理论和实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 禽流感的概述
• 1.1.1 禽流感的病原及其特性
• 1.1.2 禽流感病毒的分子生物学特性
• 1.1.2.1 禽流感病毒基因组的结构及其编码蛋白的功能
• 1.1.2.2 禽流感病毒病毒的复制
• 1.1.2.3 禽流感病毒的遗传与变异
• 1.1.3 禽流感流行的历史和现状
• 1.2 禽流感疫苗
• 1.2.1 灭活全病毒疫苗
• 1.2.2 亚单位疫苗
• 1.2.3 重组活载体疫苗
• 1.2.4 DNA 疫苗
• 1.2.5 标记疫苗
• 1.3 A 型流感病毒的反向遗传学技术
• 1.3.1 流感病毒反向遗传学技术的发展过程
• 1.3.2 流感病毒反向遗传学技术的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 试验部分
• 2.1 试验一 A/Duck/Guangxi/27/03 禽流感病毒的分子遗传与衍化分析
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 病毒
• 2.1.1.2 SPF 鸡胚
• 2.1.1.3 主要试剂及仪器
• 2.1.1.4 引物
• 2.1.1.5 病毒的增殖和鉴定
• 2.1.1.6 病毒RNA 的提取
• 2.1.1.7 病毒RNA 的RT–PCR
• 2.1.1.8 目的基因DNA 产物的连接与转化
• 2.1.1.9 阳性重组质粒的筛选
• 2.1.1.10 酚氯仿高真空绝缘硅脂粗提质粒
• 2.1.1.11 质粒DNA 的PCR 鉴定
• 2.1.1.12 质粒DNA 的纯化
• 2.1.1.13 质粒DNA 的测序
• 2.1.1.14 病毒各基因的分子遗传演化分析
• 2.1.2 结果
• 2.1.2.1 病毒RNA 的RT-PCR 产物电泳鉴定结果
• 2.1.2.2 质粒DNA的 PCR鉴定电泳鉴定结果
• 2.1.2.3 T 载体克隆质粒DNA 试剂盒纯化电泳鉴定结果
• 2.1.2.4 病毒全基因组序列测定结果与各基因的分子遗传衍化分析结果
• 2.1.3 讨论
• 2.1.3.1 HA 基因及其编码的氨基酸
• 2.1.3.2 NA 基因及其编码的氨基酸
• 2.1.3.3 禽流感病毒的内部基因演化分析
• 2.2 试验二 A/Duck/Guangxi/27/03 禽流感病毒对BALB/c 小鼠的致病性试验
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 病毒
• 2.2.1.2 试验动物
• 2.2.1.3 病毒鸡胚半数感染量（EID50）的测定
• 2.2.1.4 静脉接种致病指数（IVPI）的测定
• 2.2.1.5 病毒对小鼠的致病性试验
• 2.2.1.6 病毒对小鼠的组织嗜性试验
• 2.2.2 结果
• 2.2.2.1 病毒鸡胚半数感染量（EID50）的测定结果
• 2.2.2.2 病毒静脉接种致病指数的测定结果
• 6EID₅₀ 感染病毒后小鼠体重的变化结果'>2.2.2.3 10⁶EID₅₀感染病毒后小鼠体重的变化结果
• 2.2.2.4 鼻腔感染病毒后小鼠的死亡结果
• 2.2.2.5 病毒对小鼠的组织嗜性试验结果
• 2.2.3 讨论
• 2.3 试验三 H5N2 亚型禽流感病毒基因重组疫苗株的构建
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 病毒
• 2.3.1.2 SPF 鸡胚
• 2.3.1.3 质粒载体及转染质粒
• 2.3.1.4 主要试剂及仪器
• 2.3.1.5 引物
• 2.3.1.6 病毒RNA 的提取、反转录与PCR
• 2.3.1.7 转染质粒pBD-HA 和pBD-NA 的构建
• 2.3.1.8 病毒拯救
• 2.3.1.9 救获病毒的检测与鉴定
• 2.3.2 结果
• 2.3.2.1 病毒HA 和NA 基因的RT–PCR 电泳鉴定结果
• 2.3.2.2 pBD-HA 和pBD-NA 质粒的PCR 鉴定结果
• 2.3.2.3 转染用质粒pBD-HA 和pBD-NA 电泳鉴定结果
• 2.3.2.4 救获重组病毒 HA 和NA 基因的 PCR 鉴定结果
• 2.3.2.5 救获重组病毒的检测与鉴定结果
• 2.3.3 讨论
• 3 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介