湖南省烟草马铃薯Y病毒的株系鉴定

论文摘要

烟草马铃薯Y病毒病近年来在全国范围内不断扩展蔓延,且危害程度呈上升趋势。2008年、2009年湖南省部分烟区烟草马铃薯Y病毒病流行成灾,给这些地区烟草和马铃薯等作物造成严重的损失。但目前我们对PVY的株系及其分布所知甚少,所以迫切需要建立快速、准确的检测技术检测湖南省各烟草种植区PVY的发生情况,为合理有效地防治该病害及实施针对该病害的抗病育种工作奠定基础。2009年和2010年分别在湖南省主要烟区采取疑似感染PVY的烟叶,并以此为材料建立了用于检测PVYO株系、N株系和NTN株系的单一RT-PCR体系。在单一RT-PCR的基础上,通过对退火温度、引物浓度、Mg2+浓度等的优化建立了能够同时检测O株系、N株系和NTN株系的多重PCR。研究发现,运用降落PCR的原理设置的退火温度更适宜用于多重RT-PCR,使用固定温度作为退火温度亦可。只是要注意,多重RT-PCR使用的退火温度比单一RT-PCR要低3℃左右。同时,若不调整引物浓度,所得条带均一性差,引物浓度使用原则为：在适量减少“强”目的片段的引物量的同时增加“弱”目的片段的引物量。在优化M矿+浓度时,注意其与dNTP的浓度比值即可。通过建立的单一RT-PCR和多重RT-PCR对采集的样品进行检测得知,结果显示在湖南省的各烟区,N株系为主要优势株系,O株系少量发生,且第一次在湖南检测到NTN变异株系,而未检测到C株系和N：O株系的存在。结合分析近两年采集的所有样品,发现湖南省O株系和NTN株系的发病率呈上升趋势,虽然各地区此两种株系的变化不一。同时,检测发现PVY株系混合侵染的情况在湖南省的烟草上存在,主要以N株系和NTN株系的混合侵染模式为主,存在N株系和O株系的混合侵染,但未检测到O株系与NTN株系的混合侵染。其中,发生混合侵染的NTN株系占检测到的NTN株系的近50%,说明NTN株系参与混合侵染的比例相当的高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 烟草马铃薯Y病毒病的现状
• 1.1 烟草马铃薯Y病毒病的分布
• 1.2 烟草马铃薯Y病毒病的危害
• 2 PVY的株系分化
• 2.1 株系划分
• 2.2 株系变异
• 3 PVY的检测方法
• 3.1 生物学方法
• 3.2 血清学方法
• 3.3 分子生物学方法
• 3.3.1 聚合酶链式反应（PCR）
• 3.3.2 核酸杂交
• 4 研究意义
• 第二章 检测马铃薯Y病毒株系的单一RT-PCR的建立
• 1 材料
• 1.1 样品采集
• 1.2 主要试剂及配方
• 1.3 主要仪器
• 1.4 引物设计
• 2 方法
• 2.1 器皿的处理
• 2.2 RNA的提取
• 2.3 RNA的提取质量检测
• 2.4 单一RT-PCR检测
• 2.4.1 cDNA的合成
• 2.4.2 PCR扩增
• 2.5 感受态细胞的制备
• 2.6 PCR特异性产物的回收
• 2.7 回收产物的克隆
• 2.8 阳性克隆的菌落PCR检测
• 2.9 测序
• 3 结果与分析
• 3.1 样品采集
• 3.2 RNA提取质量检测
• 3.3 单一RT-PCR
• 3.4 回收转化克隆
• 3.5 测序结果
• 第三章 检测烟草马铃薯Y病毒株系的多重RT-PCR体系的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 退火温度的优化
• 2.1.1 以一固定温度为退火温度
• 2.1.2 使用降落PCR
• 2.2 扩增体系的优化
• 2.2.1 引物浓度的优化
• 2+浓度的优化'>2.2.2 Mg²⁺浓度的优化
• 3 结果和讨论
• 3.1 退火温度的优化
• 3.1.1 以一固定温度为退火温度
• 3.1.2 降落PCR
• 3.2 其他扩增程序的优化
• 3.2.1 退火时间
• 3.2.2 循环次数
• 3.3 扩增体系的优化
• 3.3.1 引物浓度的优化
• 2+浓度的优化'>3.3.2 Mg²⁺浓度的优化
• 3.4 优化后的多重RT-PCR
• 第四章 湖南省烟草马铃薯Y病毒株系的检测鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果和讨论
• 3.1 对样品中的PVY株系进行鉴定
• 3.2 PVY各株系的鉴定结果
• 3.2.1 N株系的鉴定结果
• 3.2.2 O株系的鉴定结果
• 3.2.3 NTN株系的鉴定结果
• 3.2.4 C株系和N:O株系的鉴定结果
• 3.3 烟草PVY株系变化特点
• 3.4 株系混合侵染情况
• 第五章 全文总结及展望
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢
• 作者简介