论文摘要
目的:细胞凋亡（apoptosis）或程序化死亡（programmed cell death, PCD）是有机体为保持自身稳定、调控自身细胞增殖与死亡之间的平衡,由基因控制的细胞主动性死亡的过程,具有特殊的形态学和生化特征,不导致明显的炎症反应,这些变化是caspase介导的特定底物分解的直接结果。研究发现Bcl-2家族的基因参与与细胞凋亡,扮演着重要的角色。Bcl-2家族由抑凋亡因子（如Bcl-2,Bcl-XL）和促凋亡因子（如Bax,Bid,Bak）组成,两组成员之间的比例决定着细胞的生死存亡。当Bax/Bcl-2比例增加时,引起细胞色素C和其他多肽从线粒体膜间隙释放入细胞质,细胞色素C活化caspase-9,后者接着活化其他caspase成员,引起细胞凋亡。白血病细胞同其他肿瘤细胞一样,其特征性表现是逃逸细胞周期调控、无限制增殖,而诱导白血病细胞凋亡是目前治疗的主要机制,用药物诱导白血病细胞发生凋亡也已成为治疗肿瘤的有效途径。随着新的化疗药物或靶向治疗药物的不断出现,急性白血病的近期和远期疗效有了明显提高,但是一些患者在治疗过程中出现原发或者继发的多药耐药（multidrug resistance,MDR）现象,导致治疗失败。MDR指白血病细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性,就同时对其他结构上无关、作用机理各异的药物也产生交叉耐药性,是一种特殊的广谱耐药现象。而耐药细胞株的建立是探讨白血病MDR产生的机制及对MDR进行逆转研究的基础。近年来,人们发现中药在诱导白血病细胞凋亡和逆转耐药方面正在显示出不容置疑的优势。中药厚朴属木兰科木兰属乔木植物,其树皮为我国传统中药材,和厚朴酚（ honokiol,HNK）是其主要化学成分之一,属于联苯酚类化合物。传统中医认为厚朴具有消除胸腹满闷、止痛、健胃、下气降逆、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用。现代医学发现和厚朴酚具有抗氧化、抗炎、抗焦虑、抗菌、抗血栓形成和抗肿瘤的作用。近年来体内外试验均证实和厚朴酚对多种实体肿瘤细胞有抑制作用,引起人们极大关注,但是国内外尚未见和厚朴酚在体外诱导U937细胞凋亡和调控凋亡相关基因的研究报道;此外,还有研究发现和厚朴酚对耐药的人多发性骨髓瘤具有逆转耐药作用。但和厚朴酚对急性白血病的相关耐药细胞株是否有逆转耐药作用,未见报导。以往研究中建立耐药细胞株时多采用药物低浓度化疗药物逐渐加量持续诱导法,这与临床短疗程、大剂量、反复用药的方式不一致。本研究模拟临床用药特点,采用高浓度反复间歇诱导的方法,建立白血病细胞株U937对阿霉素（ADR）多药耐药细胞系—U937/ADR。阿霉素（Adriamycin,ADR）是一种抗肿瘤抗生素,属于拓扑异构酶II（topoisomerase II,Topo II）毒性抑制剂,主要通过稳定Topo II-DNA断裂复合体,抑制DNA的再连接,造成DNA断裂损伤,而达到对肿瘤细胞的杀灭作用,临床疗效肯定。U937细胞系于1976年建立,遗传背景清楚,生物学性状稳定。经检索国内、外文献,未见由ADR诱导的U937细胞耐药亚系建立的报道。目前用于研究白血病耐药相关研究的理想模型较少,因此,U937/ADR的建立对今后从细胞和分子水平研究白血病多药耐药机制具有较大的实用价值,也为体外筛选化疗药物,研究耐药逆转等提供了必要的实验材料。引起白血病的多药耐药机制非常复杂,通常有多种因素参与其中。目前已经明确的与耐药有关的机制有:（1）药物吸收减少:许多药物进入进入细胞膜需要与载体蛋白结合,如果参与此过程的载体蛋白结构改变,可导致细胞对药物吸收的减少,细胞内有效药物浓度降低,其后果是细胞逐渐对药物产生耐药。如MTX、全反式维甲酸等药物。（2）细胞内药物溢出增多:①P-170糖蛋白（P-gp）介导的药物泵出,导致细胞内药物被主动泵出。诱导其过度表达产生耐药的药物有蒽环类、长春新碱、柔红霉素、表鬼臼毒素和紫杉醇等。②MRP介导的药物泵出,MRP是整合于细胞膜的糖基化磷蛋白,属于ATP酶活性的转移蛋白的超家族成员。许多天然药物如抗生素、生物碱是MRP的底物。③LRP介导的药物转运,LRP蛋白广泛分布于许多正常组织和肿瘤组织,位于核膜孔和胞浆颗粒的结构中,参与核浆之间的物质运输。在LRP高度表达的细胞中,柔红霉素可在核浆之间进行快速的重新分布,说明LRP参与了抗肿瘤药物的转移,与多药耐药有关。④乳癌耐药蛋白BCRP,与P-gp和MRP同属于ATP依赖转运,是通过药物外排泵的作用降低细胞中的药物聚集,从而引起MDR。（3）细胞解毒能力的增强:谷胱苷肽S转移酶π（GST-π）等,在许多人类肿瘤和动物致癌模型中谷胱苷肽S转移酶π（GST-π）常常高度表达,可以作为肿瘤细胞耐药的一个标志。烷化剂耐药如MTX、马法兰、苯丁酸氮芥等的耐药与GST-π有关。（4）肿瘤细胞内Topo II活性和表达量下降,引起肿瘤细胞出现不典型多药耐药。（5）凋亡调控基因介导的耐药机制:由于细胞凋亡调控的bcl-2、P53、Ras、c-myc等基因的表达失控,而导致白血病细胞对化疗药物的耐受。抗肿瘤药物是细胞凋亡的诱导剂,化疗药物的细胞毒效应可能主要是触发肿瘤细胞程序化死亡的通路,凋亡有可能是大多数化疗药物作用的最终共同途径。从这个意义上来说,白血病细胞的耐药是细胞凋亡受抑制。因此,本研究课题在建立对阿霉素耐药的细胞株U937/ADR的基础上,我们采用蛋白印迹（Western blotting）方法对U937/ADR白血病细胞产生耐药所涉及的主要蛋白、酶和凋亡调节基因:P-gp、MRP、LRP、BCRP、Topo II、GST-π和bcl-2、bax的表达量进行检测,以期能深入探讨U937/ADR的耐药机制。并进一步观察了和厚朴酚逆转U937/ADR耐药的特点,以及和厚朴酚对产生多药耐药的上游调控因子的影响,旨在初步探讨和厚朴酚逆转多药耐药的作用机制。方法:1和厚朴酚对体外培养的U937细胞增殖凋亡的影响1.1 U937白血病细胞株的体外培养采用含有10%新生牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml的RPMI 1640培养基。置于37℃,5%CO2,饱和湿度环境下培养。1.2采用噻唑蓝比色法（MTT）检测不同浓度的和厚朴酚对U937细胞和正常人外周血单个核细胞的增殖抑制率分别取相同密度的对数生长期U937细胞和正常人外周血单个核细胞,加于96孔板中培养。两种细胞分别设立实验组和对照组。实验组设立10个药物浓度组,每组HNK的终浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml,每个药物浓度组设8个复孔。对照组加入同样浓度的二甲基亚砜（DMSO）,分别培养24小时和48小时,培养结束前4h每孔加入20μl噻唑蓝（MTT）溶液（5mg/ml）,离心弃上清,加入200μl DMSO充分溶解结晶物,用酶标仪测490nm处吸光度A值,计算细胞增殖抑制率。1.3细胞周期检测乙醇固定各组U937细胞24小时后,碘化丙啶染色30分钟,上机测定细胞内DNA含量,实验结果经计算机软件ModFit LT2.0处理,计算出细胞周期的分布。1.4透射电镜观察U937细胞的超微结构变化调整U937细胞密度为1×106/ml,在含有终浓度为0、10μg/ml的HNK的RPMI1640培养液中培养12h。之后分别收集细胞,1000rpm离心10 min,PBS （pH 7.4）洗一遍,4%戊二醛固定过夜,PBS洗3遍,1%锇酸固定1h,PBS充分清洗。梯度乙醇脱水,丙酮浸透,包埋,超薄切片,醋酸双氧铀-柠檬双染,HITACHI 1200ES型透射电镜观察细胞形态变化并拍照。1.5 FCM用Annexin V/PI双染的方法检测U937细胞的凋亡率变化将U937细胞或PBMCs分别在含有不同终浓度的HNK的培养液中培养24和48小时。收集各组细胞,悬于binding buffer液中,加入AnnexinV,避光室温反应15 min,加入binding buffer液,上机检测前加入PI,用流式细胞术检测细胞凋亡率。1.6 Capase-3活性检测按每孔1×106个/ml细胞的密度将U937细胞200μl接种于6孔板,终浓度为10μg/ml的HNK处理6、12和24小时后,同时设立对照组（HNK 0μg/ml）,每组每个样本收集约2×104个细胞,加入50μl的冰cell lysis buffer重悬,冰浴10min,离心10000g/min,转移上清至新的EP管,置于冰上。测蛋白浓度后,加入相应cell lysis buffer稀释蛋白至相同浓度,加入50μl反应液及5μl 4mM DEVD-pNA,37℃孵育1小时后加入96孔板测OD405,与对照组比较,计算增加倍数。1.7检测线粒体PT孔抑制剂CsA对细胞增殖的影响按每孔1×106个/ml细胞的密度将U937细胞200μl接种于96孔板,每孔加入终浓度为5μM的Cyclosporin A（CsA）,2小时后再加入终浓度为10μg/ml的和厚朴酚处理U937细胞6h和12h;同时设立HNK单独用药组,终浓度为10μg/ml,作用同密度的U937细胞200μl 6h和12h,每组设复孔3个。收集细胞,MTT法测定细胞增殖抑制率。1.8 RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA的表达分别收集1×106/ml个U937细胞,经过终浓度为0、5、10和15μg/ml的HNK处理24小时,以Trizol提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA纯度并定量,取2μg采用M-MLV逆转录合成cDNA。以特异的引物扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳后goldview染色,图像分析系统分析扩增条带积分光密度值,以β-肌动蛋白为内参,计算mRNA相对表达水平。1.9 Western blotting法检测U937细胞中Bax和Bcl-2的蛋白表达水平采用细胞浆蛋白提取试剂盒提取经不同终浓度的HNK处理的U937细胞中的胞浆蛋白,用考马斯亮兰G250试剂盒测定蛋白浓度。每梳孔加150μg样品蛋白。采用SDS-PAGE不连续变性蛋白质电泳,电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部,参照标准分子量蛋白质,截取相应位置的凝胶转膜,封闭后结合一抗,4℃过夜,漂洗后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合,化学发光显色,扫描后分析光密度,计算蛋白含量。2人白血病多药耐药细胞株U937/ADR的建立及其生物学性状分析2.1采用阿霉素（ADR）诱导建立对其耐药的细胞株取对数生长期U937细胞,采用MTT法和IC50计算软件,筛查使50%的U937细胞生长抑制时的HNK浓度（IC50）。将U937细胞加入含有IC50浓度的ADR的RPMI1640培养液中孵育2小时后,弃含药培养液,用普通培养液继续培养,大部分细胞死亡,存活细胞缓慢生长,待存活细胞长满培养瓶后传代,进入对数生长期后,再次与此浓度的ADR孵育,如此反复换液、传代,每4周检测其耐药性,直至产生耐药性,并且在无药培养液中耐药性保持稳定。对U937/ADR细胞生物学性状分析。2.2绘制细胞生长曲线分别接种1×104个U937和U937/ADR细胞,每日进行细胞计数,共7天,按Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间。2.3克隆形成率的检测接种200个U937和U937/ADR细胞到含有甲基纤维素软琼脂培养基的24孔板,培养14天,分别计算克隆形成率（%）=形成克隆数/接种细胞数×100%。2.4流式细胞术分析细胞周期乙醇固定U937和U937/ADR细胞24小时后,碘化丙啶染色30分钟,上机测定细胞DNA含量,实验结果经计算机软件ModFit LT2.0处理,计算出细胞周期的分布。2.5采用MTT法分析耐药谱将1×106个/ml U937和U937/ADR细胞各200μl,接种到96孔板,按照不同浓度加入各种化疗药物（足叶乙甙、吡喃阿霉素、长春新碱、米托蒽醌、阿糖胞苷）,作用24小时,采用MTT法计算细胞增殖抑制率。采用IC50计算软件,计算出使50%U937细胞和U937/ADR细胞生长抑制师弟各种药物浓度（IC50）,由此计算耐药指数（resistant index,RI）= U937/ADR耐药细胞的IC50/U937亲代细胞的IC50。2.6耐药机制研究:采用western blotting检测U937细胞和U937/ADR细胞的P-gp、MRP1、LRP、BCRP、GST-π、Topo II、bcl-2、Bax蛋白表达3和厚朴酚对人急性白血病多药耐药细胞系U937/ADR耐药的影响3.1噻唑蓝（MTT）法体外药敏检测取对数生长期的U937/ADR细胞（2×104/ml） 200μl接种于96孔培养板,分别加入不同终浓度的HNK溶液,每个浓度组设3个重复孔。对照组加入相应溶剂。37℃孵育72h后加入MTT,继续培养4h,弃上清,加入二甲基亚砜,混匀后置于酶标仪,测定570 nm波长的吸光度值（A）,计算出使50%和20%的U937/ADR细胞生长抑制时的HNK浓度（IC50,IC20）3.2检测HNK对U937/ADR的耐药逆转作用取HNK对U937/ADR细胞的IC20浓度做耐药逆转实验。取对数生长期的U937/ADR细胞,以1×105/ml细胞密度接种于96孔培养板中,每孔加入200μl。24h后加入20μl用无血清的RPMI 1640培养基稀释的HNK （终浓度为0,6.5μg/ml）和浓度为0,2、4、6、8、10μg/ml的ADR 20μl,每种药物浓度均做3个复孔。置5 %CO2 ,37℃培养24 h后,每孔加5mg/ml MTT 25μl,37℃继续培养4 h后终止培养,小心吸弃上清液,每孔加150μl DMSO,振荡10 min使结晶物充分溶解。用酶标仪测D570。按照金氏公式[1]:Q=（Ea+b）/（Ea+Eb-Ea×Eb）判断两药合用的药理效应。公式中Ea代表HNK的细胞增殖抑制率,Eb代表ADR的细胞增殖抑制率,Ea+b代表两药联合应用的细胞增殖抑制率,即实测合并效应;Ea+Eb-Ea×Eb为期望合并效应。Q值在0.851.15时,两药联合应用效应相加（+）,Q值在1.1520之间为协同（++）,Q值>20为明显协同（+++）,Q值在0.850.05之间为拮抗（-）,Q值<0.05为明显拮抗（――）。本实验比较了HNK处理组与不加HNK处理的对照组的ADR IC50值的差异,从而判断HNK的增敏作用,并计算增敏倍数。增敏倍数=无增敏剂时的IC50值/增敏剂作用下的IC50值。3.3 HNK对U937/ADR细胞P-gp功能的影响罗丹明123孵育法检测:U937/ADR细胞和亲代U937细胞密度为5×106个/ml,加入HNK（终浓度0、6.5μg/ml）置5 %CO2,37℃分别培养1h和12h,再加入罗丹明123（180ng/ml）2ml,共培养60min;2000r/min离心,去上清,U937/ADR细胞用PBS洗2次,把细胞重新悬浮于5ml生理盐水中,加入-20℃,75%乙醇10ml,冰浴30min,流式细胞仪检测细胞内的荧光强度。3.4 NF-κB对HNK逆转U937/ADR多药耐药机制的调控3.4.1 U937/ADR细胞和U937细胞内NF-κB的激活情况分别提取U937/ADR和U937细胞的核蛋白,测定蛋白浓度。（方法同第二部分）,应用康成生物公司ArrayStar?检测转录因子NF-κB活性的ELISA试剂盒检测NF-κB的活性。在检测NF-κB活性的试剂盒中,标记探针是生物素标记的双链寡核苷酸片断,含有NF-κB特异性DNA结合序列（5-gggactttcc-3）。当标记探针与细胞核抽提物一起孵育时,核抽提物中活性形式的NF-κB与探针特异性结合。随后转录因子/探针复合物与链亲和素包被的微孔板孵育,转录因子/探针复合物与微孔板上链亲和素结合固定在微孔板上。洗去未结合物,加入抗p65特异性一抗。然后加入HRP标记的二抗及底物,HRP催化底物发生颜色改变。根据颜色深浅即可检测NF-κB p65或p50 DNA结合活性改变3.4.2 HNK对U937/ADR细胞内NF-κB/p65转录因子的DNA结合活性及P-gp表达的影响用终浓度为0,2,4,6,8,10μg/ml的HNK分别作用于1×106/ml U937/ADR细胞12h后,提取细胞核蛋白,测定蛋白浓度（同第1部分）。NF-κB/p65活性检测同前,Western blotting方法检测P-gp蛋白表达,方法同前。结果:1.和厚朴酚对体外培养的U937细胞和正常外周血单个核细胞增殖的影响1.1 HNK抑制U937细胞增殖结果显示HNK作用24h的IC50为13.2μg/ml , 48小时的IC50为11.8μg/ml;高浓度组（25μg/ml）对U937细胞的生长抑制率均达90%以上,且增殖抑制作用随HNK浓度的加大和作用时间的延长而增强,呈现出剂量和时间效应关系。而对正常外周血单个核细胞的增殖抑制作用不明显。1.2 HNK使U937细胞阻滞在G0/G1期HNK作用于U937细胞后,G0/G1期细胞所占比例随着HNK作用时间的延长而增加,S期与G2/M期细胞所占比例则呈时间依赖性下降。1.3电镜观察结果显示HNK诱导U937细胞凋亡经和厚朴酚作用后,U937细胞呈现凋亡形态（包括细胞膜皱缩和起泡、染色质凝聚、核碎裂和凋亡小体的形成）。而空白对照的U937细胞的电镜下形态,未见明显凋亡形态特征。1.4 AnnexinV/PI方法进一步证实HNK诱导U937细胞凋亡HNK作用于U937和PBMCs后,凋亡的U937细胞所占比例随着药物浓度和作用时间的增加而增加,呈现对HNK的时间-浓度依赖性。1.5 HNK处理U937细胞后Caspase-3活性增强终浓度为10μg/ml的HNK处理U937细胞6、12和24小时后,处理组的caspase-3活性与对照组caspase-3活性比值分别为:1.94±0.05,3.59±0.31,11.91±0.17。U937细胞经HNK处理12和24小时后,细胞内caspase-3活性较对照组有显著增高（P<0.01）1.6线粒体PT孔抑制剂CsA能降低HNK对U937细胞的增殖抑制作用单独用HNK或用线粒体PT孔抑制剂环胞菌素A（CsA,终浓度5μM）与终浓度为10μg/ml的HNK联合处理U937细胞后,细胞增殖抑制率有所不同。HNK单独作用6h、12h的细胞增殖抑制率分别为8.45±0.35%,31.25±1.30%。而CsA和HNK联合作用6h、12h后,细胞增殖抑制率依次为3.14±0.51%,19.39±0.92%,较HNK单独处理组明显降低（P<0.05）,同时5μM CsA对U937细胞基本无毒性作用。1.7 HNK影响U937细胞内bcl-2和bax mRNA的表达与对照组U937细胞相比,HNK处理组的U937细胞内Bax mRNA的表达量呈明显的剂量依赖性上升趋势,而Bcl-2 mRNA表达变化无统计学差异。各浓度组的Bcl-2与Bax表达量的比值呈减少趋势。1.8 HNK影响U937细胞内的Bcl-2和Bax蛋白的表达U937细胞经HNK处理后,Bax蛋白的表达水平与对照组细胞蛋白的表达量比较呈现升高趋势,各组间有统计学差异;Bcl-2蛋白在各浓度组的表达水平与对照组相比无明显差异;各浓度Bcl-2与Bax蛋白表达的比值呈减少趋势。2人白血病多药耐药细胞系U937/ADR的建立及其生物学性状分析结果2.1成功建立U937/ADR细胞株采用大剂量（IC50浓度:0.85μg/ml）的ADR短时间（2h）暴露法,历时32周,经过45次传代,成功建立U937细胞系的ADR耐药细胞亚系,命名为U937/ADR。U937细胞对ADR的IC50为0.85μg/ml,U937/ADR细胞对ADR的IC50为9.35μg/ml ,耐药指数为11倍。在普通培养液中培养2周后,其耐药性仍稳定。2.2检测U937/ADR的生长曲线和克隆形成率与亲代U937细胞有差异U937及U937/ADR在普通培养液中的生长曲线显示:U937细胞的群体倍增时间为34.7h,U937/ADR群体倍增时间为43.6h,增加8.9h;而U937及U937/ADR在ADR浓度为0.85μg/ml的培养液中的生长曲线显示:U937/ADR的倍增时间为46.9小时,但U937细胞不能生长,72小时后细胞几乎全部死亡;克隆形成率检测显示,U937/ADR及U937细胞的克隆形成率分别为81%及86%,无统计学差异（P>0.05）。2.3处于G0/G1期的U937/ADR细胞增多与U937细胞相比U937/ADR的G0/G1期细胞增多,而G2/M期细胞减少,两种细胞系S期细胞无明显变化。2.4 U937ADR细胞呈现多药耐药U937/ADR细胞系对ADR的耐药指数为11,除此之外,该细胞系对VP-16、THP、VCR、MTX等药物也产生了交叉耐药,耐药倍数分别为6.5、13.4、6.1、4.8,对Ara-C仍保持敏感。2.5与耐药相关的P-gp在U937/ADR中高表达在亲代U937和耐药的U937/ADR细胞株中,均有P-gp、LRP、GST-π、Topo II、bcl-2、Bax的表达,尤其是P-gp在U937/ADR中的表达水平显著高于其在U937细胞中的表达,二者有显著统计学差异（P<0.05）。MRP1和BCRP在两种细胞株中均未见表达。3和厚朴酚对人急性白血病多药耐药细胞系U937/ADR耐药机制的影响3.1 HNK对U937/ADR细胞的IC50和IC20值HNK处理U937/ADR细胞24小时后,使50%和20%的U937/ADR细胞生长抑制的浓度为:IC50值14.3μg/ml,IC20值6.5μg/ml。3.2 HNK可以逆转U937/ADR细胞对ADR的耐药我们选取终浓度为6.5μg/ml的HNK做耐药逆转实验。分组实验结果显示:以终浓度为6.5μg/ml的HNK与不同浓度ADR合用,随着药物浓度的增加,对U937/ADR细胞的增殖抑制率明显增加,两药合用组的抑制率明显高于单独用药组。根据金氏公式计算,两药合用有协同作用,并且其协同作用随着ADR药物浓度的增加而增强（见表3-2）。与终浓度为6.5μg/ml HNK的联合用药时,ADR的IC50是4.28μg/ml,增敏倍数=9.35/4.28=2.2（P<0.05）3.3罗丹明123实验证实HNK可使U937/ADR细胞内罗丹明123增加U937/ADR细胞经终浓度为6.5μg/ml的HNK处理1h后,与未经HNK处理组比较,细胞内罗丹明123的平均荧光强度值差异无显著性（P>0.05）;但将终浓度为6.5μg/ml的HNK处理时间延长至12h后,与未经HNK处理组比较,细胞内罗丹明123的平均荧光强度值明显增高（处理组710±12.26,对照组1639±28.13）,有显著差异性（P<0.01）。同时检测终浓度为0、6.5μg/ml的HNK对亲代U937细胞的作用1h或12h,没有明显影响。3.4 NF-κB对HNK逆转U937/ADR多药耐药机制的调控3.4.1 U937/ADR细胞核内NF-κB/p65的活性增强在亲代U937细胞核蛋白中,未检测到NF-κB/p65或p50的活性（反应孔中无颜色的变化）;而在U937/ADR细胞核蛋白中,可以检测到NF-κB/p65的活性增强（反应孔中颜色变为茶色）,但未检测到p50活性。3.4.2 HNK影响U937/ADR细胞中NF-κB/p65的DNA结合活性和P-gp表达终浓度为2μg/ml的HNK作用于U937/ADR细胞6h后,细胞中NF-κB/p65的活性（0.898±0.013）,与未经HNK处理的U937/ADR细胞中NF-κB/p65的活性（0.922±0.005）相比略微下调,但差异没有统计学意义（P=0.093）。随着HNK作用浓度的增加,NF-κB/p65蛋白的活性呈逐渐下调。终浓度为4、6、8μg/ml的HNK处理组的U937ADR细胞中NF-κB/p65蛋白的活性分别为0.719±0.004,0.472±0.019,0.386±0.006,在HNK终浓度达到10μg/ml时,NF-κB/p65的活性下降到0.259±0.011,比对照组减少,经统计学分析,差异有显著性（P<0.05）。经Pearson直线相关法分析,结果显示:NF-κB/p65的DNA结合活性变化与HNK的浓度呈负相关（r=-0.313,P=0.017）。见表3-3。在空白对照组中,P-gp蛋白的表达水平为59.85±24.38,随着HNK作用浓度的增加,P-gp蛋白的表达水平呈下调趋势,当HNK终浓度达到10μg/ml时,P-gp的表达水平下降到31.74±16.06。与对照组相比,有统计学差异（P<0.05）。经Pearson直线相关法分析显示:P-gp蛋白表达水平与HNK的浓度呈负相关（r=-0.420,P=0.008）。Pearson直线相关分析法结果显示,U937/ADR细胞中NFκB/p65的活性变化与P-gp蛋白的表达呈正相关（r=0.528,P=0.013）结论:1. HNK对白血病细胞系U937细胞的增殖有明显的抑制作用,并可以时间和浓度依赖方式促进U937细胞的凋亡,其作用机制可能与抑制U937的细胞分裂和诱导促凋亡基因Bax表达有关。2.本实验采用高浓度反复间歇诱导的方法,建立了对阿霉素耐药的细胞系U937/ADR,与亲代细胞相比,U937/ADR的生长速度减慢,该细胞系对阿霉素的耐药倍数为11,除此之外,该细胞系其它化疗药物也产生了交叉耐药,属于典型的多药耐药细胞系。3.和厚朴酚与阿霉素序贯联合应用可产生协同抗白血病作用,在体外能明显提高ADR对U937/ADR耐药株的增殖抑制作用,并能下调P-gp的表达,可有效逆转多药耐药。4.和厚朴酚可以通过减少细胞内NF-κB/p65活化水平、可以下调P-gp的表达,而提高耐药细胞U937/ADR对化疗药物的敏感性,从而逆转耐药。5.和厚朴酚可能是一种有效的治疗急性白血病的药物。