论文摘要
第一部分促红细胞生成素受体在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶致C57BL/6小鼠多巴胺能神经元损伤模型不同脑区的表达变化目的探讨促红细胞生成素受体（Erythropoietin receptor, EPOR）在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methy1-4-phenvl-1, 2, 3, 6-tetrahvdropvridine, MPTP）致C57BL/6小鼠多巴胺能神经元损伤模型中不同脑区不同时程的表达变化。方法采用腹腔注射MPTP制备C57BL/6小鼠PD模型。36只雄性C57BL/6小鼠,随机分为7组（n=12只）:对照组、MPTP1d组、MPTP2d组、MPTP4d组、MPTP7d组、MPTP14d组、MPTP21d组。在末次注射MPTP后的相应时间将动物处死,Western blot法检测腹侧中脑、纹状体、皮质区EPOR的表达;免疫组化法检测腹侧中脑、纹状体、皮质区EPOR阳性细胞数。结果MPTP致伤显著增加C56BL/6小鼠腹侧中脑EPOR的表达,在末次注射MPTP4天后开始升高,并且进行性增加至21天。MPTP对纹状体区与皮质区EPOR的表达均无显著性影响。结论MPTP所致腹侧中脑区EPOR蛋白表达增加可能与PD发生发展的病理机制有关。第二部分促红细胞生成素对1-甲基-4-苯基吡啶离子致PC12细胞损伤的抗凋亡作用及其机制研究目的探讨促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methy14-phenylpyridinium,MPP+）诱导PC12细胞变性损伤的保护作用及其机制。方法以MPP+损伤PC12细胞为帕金森病细胞模型,将培养的PC12细胞,分为3组:空白对照组、MPP+组、EPO+MPP+组。对照组给予无血清的DMEM培养基培养,MPP+组给予500μmol/L的MPP+处理24 h,EPO+MPP+组给予不同浓度的EPO（0.1U、0.3 U、1 U、3 U、10 U/ml）与500μmol/L的MPP+同时处理24 h。上述各组细胞加药孵育24 h后,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞存活率,流式细胞术与TUNEL法检测细胞凋亡,2′,7′-dichlorofluorescin diacetate （DCF-DA）染色检测细胞内活性氧（ROS）的含量,罗丹明123 （Rhodamine123, Rh123）染色检测细胞线粒体膜电位（△Ψm）,荧光法检测Caspase-3活性,Western blot法检测Bax与Bcl-2蛋白表达。结果①500μmol/L的MPP+可以导致PC12细胞存活率下降,凋亡率增加;0.1-10 U/ml的EPO可以使PC12细胞存活率增加,凋亡率降低,并在1U/ml时达到最大保护效应;②MPP+导致ROS含量增加、△Ψm降低、Caspase-3活性增加; EPO可以抑制MPP+所致ROS、△Ψm和Caspase-3水平的变化;③MPP+组较空白对照组相比,Bax/Bcl-2比率增加;而EPO-MPP+组较MPP+组相比,Bax/Bcl-2比率降低。结论EPO对MPP+致PC12细胞损伤具有保护作用,其机制是通过EPO抗氧化应激及抗凋亡的特性而实现的。第三部分促红细胞生成素对MPP+致PC12细胞损伤的保护作用通路实验一Akt/GSK-3β/Caspase-3通路在促红细胞生成素对MPP+致PC12细胞损伤保护中的作用目的研究EPO对MPP+致PC12细胞损伤保护作用中Akt/GSK-3β/Caspase-3通路的作用。方法以500μmol/L的MPP+损伤PC12细胞为帕金森病细胞模型,实验分组如下:空白对照组、LY294002组、LiCl组、MPP+组、MPP++EPO组、MPP++LiCl组、MPP++EPO+LY294002组。空白对照组、LY294002组、LiCl组、MPP+组、MPP++EPO组分别给予无血清DMEM培养基、10μmol/L的LY294002、20 mmol/L的LiCl、500μmol/L的MPP+、500μmol/L的MPP+ +1 U/ml的EPO处理;MPP++LiCl组先给予20 mmol/L的LiCl,1 h后给予500μmol/L的MPP+处理;MPP++EPO+LY294002组先给予10μmol/L的LY294002,1 h后给予500μmol/L的MPP+ +1 U/ml的EPO处理。孵育24 h后采用MTT法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡;孵育0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h之后采用检测Western免疫印迹法检测Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达;孵育0 h、4 h、8 h、16 h之后采用荧光法检测Caspase-3活性的变化。结果①MPP+和/或EPO均可以诱导p-Akt表达增加;加用LY294002后p-Akt表达降低。②应用LY294002拮抗了EPO对于PC12细胞的保护作用。③MPP+和/或EPO均可以诱导p-GSK-3β表达增加;加用LY294002后p-GSK-3β表达降低。④应用LiCl拮抗了MPP+对于PC12细胞的损伤作用。⑤MPP+致PC12细胞内Caspase-3活性增加,EPO和LiCl对MPP+所致的Caspase-3活性增加均有抑制作用;应用LY294002拮抗了EPO对Caspase-3活性的抑制作用。结论EPO对MPP+致PC12细胞损伤的保护作用是通过Akt/GSK-3b/Caspase-3通路发挥作用。.实验二ERK通路在促红细胞生成素对MPP+致PC12细胞损伤保护中的作用目的研究EPO对MPP+致PC12细胞损伤保护作用中ERK通路的作用。方法以500μmol/L的MPP+损伤PC12细胞为帕金森病细胞模型,实验分组如下:空白对照组、PD98059组、MPP+组、MPP++EPO组、MPP++EPO+PD98059组。空白对照组、PD98059组、MPP+组、MPP++EPO组分别给予无血清DMEM培养基、50μmol/L的PD98059、500μmol/L的MPP+、500μmol/L的MPP+ +1 U/ml的EPO处理; MPP++EPO+ PD98059组先给予50μmol/L的PD98059 ,1 h后给予500μmol/L的MPP+ +1 U/ml的EPO处理。上述各组孵育24 h后采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡;孵育0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h之后采用Western免疫印迹法检测p-ERK、ERK蛋白表达。结果①MPP+和/或EPO均可以诱导p-ERK表达短暂增加;加用PD98059后p-ERK表达降低。②应用PD98059并不能拮抗EPO对于PC12细胞的保护作用。结论EPO可以短暂激活ERK通路,但ERK通路并没有在EPO对MPP+致PC12细胞损伤的保护作用中发挥作用。
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