异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗的制备及抗小鼠肿瘤作用研究

论文摘要

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是原癌基因c-erbB基因编码的170kDa跨膜糖蛋白,具有胞内酪氨酸激酶活性。由于在多种上皮恶性肿瘤中,EGFR都发生一定程度的突变或异常高表达,且与肿瘤患者的不良预后密切相关。因此,EGFR是一种肿瘤的标志性抗原,可将其作为肿瘤治疗的靶点之一。本研究首次将鸡源EGFR（cEGFR）胞外Ⅱ-Ⅲ区作为抗原,免疫球蛋白IgG-Fc片段作为疫苗载体分子与cEGFR片段融合,构建了重组DNA疫苗和蛋白质疫苗,评价这两种疫苗在小鼠Lewis肺癌模型中的抗肿瘤主动免疫疗效,探讨其抗肿瘤作用机制。我们用重叠延伸PCR法扩增获得cEGFR-Fc融合基因,克隆至pVAX1质粒构建重组DNA疫苗pVAX1-cEGFR-Fc,同时,构建载有溶葡球菌酶信号肽序列的pET-28a（+）-S公用分泌型大肠杆菌表达载体,将cEGFR-Fc融合基因克隆至该载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达的融合蛋白cEGFR-Fc经Protein A亲和层析纯化后作为蛋白疫苗。48只C57BL/6J小鼠随机平分为4组:单用DNA疫苗组、单用蛋白质疫苗组、DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫组及生理盐水对照组,各组小鼠免疫4次后接种Lewis肺癌细胞,观测肿瘤生长情况及小鼠生存状态及毒副反应。19天后脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤称重并计算抑瘤率。Western blot法检测小鼠血清中是否产生了抗EGFR抗体,ELISA法检测抗体滴度。分离免疫小鼠脾脏细胞,检测淋巴细胞对靶细胞A431的细胞毒性作用。本研究成功构建了重组质粒pVAX1-cEGFR-Fc和pET28a（+）-S-cEGFR-Fc,其中,pET28a（+）-S-cEGFR-Fc转化大肠杆菌后,经诱导表达在发酵上清液中获得了30～35%分泌蛋白,经Protein A亲和层析纯化,得到纯度达85%以上的重组融合蛋白。动物实验结果表明,三疫苗组小鼠肿瘤明显小于生理盐水对照组（P＜0.01）,联合免疫组小鼠肿瘤亦明显小于DNA疫苗组、蛋白疫苗组（P＜0.01）。DNA疫苗组、蛋白质疫苗组和联合免疫组抑瘤率分别为37%、49%和63%。三疫苗组小鼠血清中均有抗EGFR抗体产生,其中联合免疫组抗体滴度最高,蛋白质疫苗组次之,DNA疫苗组最低。免疫后的小鼠脾脏细胞对EGFR受体高表达的A431细胞具有杀伤作用,效靶比为10:1时具有最大杀伤率。本研究证实,异种同源EGFR胞外Ⅱ-Ⅲ区重组DNA疫苗和蛋白质疫苗能打破机体对自身EGFR分子的免疫耐受,产生特异性免疫反应,对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用。两种疫苗的联合使用可进一步加强抑瘤作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.EGFR及其生物学功能
• 1.1 EGFR的结构特征
• 1.2 EGFR信号传导通路
• 2.EGFR信号通路与肿瘤
• 2.1 EGFR过度表达
• 2.2 EGFR酪氨酸激酶区突变
• 2.3 EGFR基因重排
• 2.4 配体自分泌机制
• 3.靶向EGFR肿瘤治疗进展
• 3.1 小分子酪氨酸激酶抑制剂
• 3.2 靶向EGFR单克隆抗体
• 3.3 EGFR靶向主动免疫治疗
• 第二章 异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗的构建
• 1.实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基及主要溶液
• 1.3.1 大肠杆菌操作相关试剂
• 1.3.2 琼脂糖凝胶电泳相关试剂、缓冲液
• 1.3.3 质粒大量制备相关试剂
• 1.3.4 SDS-PAGE相关试剂、缓冲液
• 1.3.5 WESTERN BOLT相关试剂、缓冲液
• 1.3.6 PROTEIN A-SEPHAROSE FAST FLOW蛋白层析缓冲液
• 1.3.7 其他溶液、缓冲液
• 1.4 主要实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 鸡睾丸组织cDNA的获得
• 2.1.1 鸡睾丸组织总RNA提取
• 2.1.2 鸡睾丸组织总RNA反转录
• 2.2 重叠延伸拼接PCR扩增cEGFR-Fc融合基因
• 2.3 DNA疫苗质粒pVAX1-cEGFR-Fc的制备
• 2.3.1 PCR产物的回收
• 2.3.2 PCR产物TA克隆
• 2.3.3 大肠杆菌DH5A感受态细胞的制备
• 2.3.4 连接产物转化大肠杆菌DH5A感受态细胞
• 2.3.5 大肠杆菌转化子的筛选与鉴定
• 2.3.6 重组质粒DNA提取
• 2.3.7 酶切鉴定质粒
• 2.3.8 重组质粒PVAX1-cEGFR-Fc的构建
• 2.4 pET-28A（+）-S-cEGFR-Fc表达载体的构建
• 2.5 cEGFR-Fc重组蛋白的表达、鉴定及纯化
• 2.5.1 cEGFR-Fc重组蛋白的诱导表达
• 2.5.2 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.5.3 免疫印记（WESTERN BLOT）法检测表达产物
• 2.5.4 重组工程菌的发酵及发酵液预处理
• 2.5.5 PROTEIN A-SEPHAROSE FAST FLOW亲和层析纯化目的蛋白
• 2.5.6 蛋白浓度测定
• 3.实验结果
• 3.1 鸡睾丸组织总RNA提取
• 3.2 重叠延伸拼接PCR扩增cEGFR-Fc融合基因
• 3.3 测序鉴定
• 3.4 重组质粒鉴定及序列分析
• 3.5 表达产物SDS-PAGE分析
• 3.6 表达产物WESTERN BLOT鉴定
• 3.7 发酵液目的蛋白纯化和鉴定
• 4.讨论
• 5.小结
• 第三章 DNA疫苗和蛋白质疫苗抗小鼠肿瘤的作用研究
• 1.实验材料
• 1.1 动物和细胞系
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液配制
• 1.4 主要实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 细胞培养和收集
• 2.2 DNA疫苗和蛋白质疫苗免疫动物
• 2.3 小鼠LEWIS肺癌模型的建立
• 2.4 肿瘤生长曲线的绘制并计算抑瘤率
• 2.5 WESTERN BLOT法检测小鼠血清中抗EGFR抗体
• 2.6 酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清抗EGFR抗体效价
• 2.7 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性的检测
• 2.8 安全性观察
• 2.9 统计学分析
• 3.实验结果
• 3.1 重组疫苗的抗肿瘤效果
• 3.1.1 肿瘤体积的测量
• 3.1.2 肿瘤重量和抑瘤率
• 3.2 重组疫苗免疫诱导产生抗自身免疫反应
• 3.2.1 WESTERN BLOT法检测小鼠血清中抗EGFR抗体
• 3.2.2 ELISA法测定血清抗EGFR抗体效价
• 3.3 CTL杀伤活性检测
• 3.4 安全性观察
• 4.讨论
• 5.小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者攻读研究生期间发表论文情况