金黄杆菌来源的角蛋白酶的分离纯化和酶学性质研究

论文摘要

Chryseobacterium sp.具有产高活性角蛋白酶的能力。本文从其发酵产物出发,经过硫酸铵分级盐析,Q-SepharoseTMFast Flow柱层析,Sephadex G-75凝胶柱层析,纯化产物可以在SDS-PAGE上得到单一条带,经检测具有角蛋白酶活性,确定为角蛋白酶。该角蛋白酶分子量为30 kDa左右,最适作用温度为40℃,在30℃,40℃和50℃条件下,角蛋白酶具有较好的稳定性。最适合作用pH值为8,最适缓冲液为Tris-HCl缓冲液,并且在pH7-9范围内角蛋白酶比较稳定。Ca2+,Mg2+,K+等对角蛋白酶具有强烈的激活作用,而Fe3+,Co2+,Zn2+,Cu2+等离子可以抑制角蛋白酶的活性。PMSF强烈抑制角蛋白酶的活性,说明该角蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族,EDTA也能起到部分抑制作用,推测某些金属离子在该角蛋白酶稳定性方面起到重要作用。5%的甘油浓度促进角蛋白酶的活性,而乙醇则起到抑制作用。酶促进反应动力学实验表明该角蛋白酶可以降解一系列角蛋白底物（如羽毛,羊毛,头发,Azure Keratin）,Lineweaver-Burk作图曲线表明:在以羊毛作为底物时,Km和Vmax分别为17.5mg/ml和2500（1000·A280/ml/min）。另外,该角蛋白酶对酪蛋白和偶氮酪蛋白具有强烈的水解作用。考察了该角蛋白酶对羊毛织物的生态防毡缩效果。其中选用了诺维信公司产的Savinase 16L和Ajinomoto公司的Transglutaminase作为对照,并采用非氯氧化剂H2O2做前处理,结果表明,羊毛织物在经双氧水—角蛋白酶联合处理后,羊毛表面鳞片破坏明显,有些甚至已经脱落,能够有效地起到防毡缩的效果。因此,这种高效,廉价同时环境友好的的角蛋白酶可以用于新型的纺织用酶的开发。但是,仍需要做进一步深入的研究以考察其潜在的应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 角蛋白酶产生菌
• 1.1.1 细菌
• 1.1.2 放线菌
• 1.1.3 真菌
• 1.2 角蛋白酶的性质
• 1.2.1 pH和温度动力学
• 1.2.2 分子量和等电点大小
• 1.2.3 底物的特异性
• 1.2.4 抑制剂，金属离子，有机溶剂和还原剂对角蛋白酶活性的影响
• 1.2.5 基因序列和氨基酸序列
• 1.3 角蛋白酶的活性测定方法
• 1.3.1 以酪蛋白或血红蛋白为底物的测定方法
• 1.3.2 以羽毛（粉）为底物的测定方法
• 1.3.2.1 减量法
• 1.3.2.2 比色法
• 1.3.3 以化学修饰角蛋白为底物的测定方法
• 1.4 角蛋白酶的作用机理
• 1.4.1 物理压力理论
• 1.4.2 膜电位理论
• 1.4.3 复合酶理论
• 1.4.4 无机变性理论
• 1.5 角蛋白酶的应用
• 1.5.1 饲料工业
• 1.5.2 医疗行业
• 1.5.3 皮革工业
• 1.5.4 洗涤剂行业
• 1.5.5 农业领域
• 1.5.6 其它领域
• 1.6 选题依据和研究的主要内容
• 1.6.1 选题依据
• 1.6.2 研究的主要内容
• 第2章 角蛋白酶的分离纯化研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 培养基
• 2.2.2.1 种子培养基
• 2.2.2.2 发酵培养基
• 2.2.3 培养方法
• 2.2.4 试剂
• 2.2.5 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 酶活测定方法
• 2.3.2 蛋白含量的测定
• 2.3.3 发酵液的制备
• 2.3.4 盐析
• 2.3.4.1 盐析最适pH值的确定
• 2.3.4.2 盐析对角蛋白酶沉淀的影响
• 2.3.5 有机溶剂沉淀-丙酮沉淀
• 2.3.5.1 有机溶剂用量对角蛋白酶沉淀的影响
• 2.3.5.2 离子强度对有机溶剂沉淀酶的影响
• 2.3.5.3 某些金属离子对有机溶剂沉淀酶的影响
• 2.3.6 离子交换层析
• 2.3.6.1 离子交换树脂的选择
• 2.3.6.2 缓冲液pH的选择
• 2.3.6.3 洗脱条件的选择
• 2.3.7 蛋白酶液的浓缩
• 2.3.8 凝胶柱层析
• 2.3.9 角蛋白酶的鉴定
• 2.3.9.1 角蛋白酶的纯度鉴定-SDS-PAGE
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 盐析
• 2.4.1.1 盐析最适pH值的确定
• 2.4.1.2 盐析对角蛋白酶活的影响
• 2.4.2 有机溶剂沉淀
• 2.4.2.1 有机溶剂用量对角蛋白酶沉淀的影响
• 2.4.2.2 离子强度对角蛋白酶沉淀的影响
• 2.4.2.3 某些金属离子对有机溶剂沉淀酶的影响
• 2.4.3 离子交换层析
• 2.4.3.1 阳离子交换层析
• 2.4.3.2 阴离子交换层析
• 2.4.3.3 分离和洗脱条件的确定
• 2.4.4 凝胶柱层析
• 2.4.5 角蛋白酶的鉴定
• 2.5 本章小结
• 第3章 角蛋白酶的酶学性质和酶促反应动力学研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 试剂和缓冲液
• 3.2.1.1 试剂
• 3.2.1.2 缓冲液
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 酶活测定方法
• 3.3.1.1 以一般角蛋白为底物的酶活测定方法
• 3.3.1.2 以化学合成角蛋白（Azure Keratin）为底物的酶活测定方法
• 3.3.1.3 以Casein为底物的蛋白酶活测定方法
• 3.3.1.4 以Azocasein为底物的蛋白酶活测定方法
• 3.3.2 角蛋白酶的酶学性质研究
• 3.3.2.1 角蛋白酶的最适反应温度
• 3.3.2.2 角蛋白酶的热稳定性
• 3.3.2.3 角蛋白酶的最适作用pH
• 3.3.2.4 角蛋白酶的酸碱稳定性
• 3.3.2.5 金属离子对角蛋白酶活的影响
• 3.3.2.6 抑制剂，螯合剂，有机溶剂等对角蛋白酶活的影响
• 3.3.3 角蛋白酶的酶促反应动力学的研究
• 3.3.3.1 角蛋白酶的反应初速度确定
• m值和最大反应速度'>3.3.3.2 角蛋白酶的K_m值和最大反应速度
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 角蛋白酶的酶学性质研究
• 3.4.1.1 角蛋白酶的最适反应温度
• 3.4.1.2 角蛋白酶的热稳定性
• 3.4.1.3 角蛋白酶的最适作用pH
• 3.4.1.4 角蛋白酶的酸碱稳定性
• 3.4.1.5 金属离子对角蛋白酶活的影响
• 3.4.1.6 抑制剂，螯合剂，有机溶剂以及表面活性剂等对角蛋白酶活性的影响
• 3.4.2 角蛋白酶的酶促反应动力学的研究
• 3.4.2.1 角蛋白酶的反应初速度确定
• m值和最大反应速度'>3.4.2.2 角蛋白酶的K_m值和最大反应速度
• 3.5 本章小结
• 第4章 角蛋白酶的应用初探
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 羊毛织物的处理工艺
• 4.3.2 羊毛织物减量率测试
• 4.3.3 羊毛织物毡缩率测试
• 4.3.4 羊毛织物撕破强力测试
• 4.3.5 羊毛织物摩擦系数和定向摩擦效应测试
• 4.3.6 羊毛纤维的电镜扫描
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 羊毛织物减量率测试
• 4.4.2 羊毛织物毡缩率测试
• 4.4.3 羊毛织物撕破强力测试
• 4.4.4 羊毛织物摩擦系数和定向摩擦效应测定
• 4.4.5 羊毛纤维的电镜扫描
• 4.5 本章小结
• 第5章 结论和建议
• 5.1 本论文的主要结论
• 5.2 后期研究展望
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文及成果
• 致谢