应用酵母双杂交技术筛选与香鱼LECT2互作的蛋白

论文摘要

白细胞衍生趋化因子（leukocyte cell-derived chemotaxin 2, LECT2）是一个多功能的蛋白质,涉及到细胞生长、分化、损伤修复及免疫等过程并且参与了免疫应答防御机制的调控,但其作用机制尚不明确。本研究以香鱼LECT2为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选与之互作的蛋白,通过蛋白之间的互作关系,解析鱼类LECT2的生理功能及其作用机制。本研究首先从香鱼肝脏cDNA文库中获得LECT2基因,其全长cDNA为547个核苷酸,3’末端具有polyA尾,单一大开读框编码一个由156个氨基酸组成的分子量为17 kDa的蛋白质。以香鱼LECT2 （FM253748）为诱饵,应用酵母双杂交技术从香鱼肝脏cDNA文库（独立克隆为2.5×106）中筛选到9个候选基因,经鉴定其中7个为转铁蛋白（transferrin, Tf）,其余2个为C型凝集素受体（C-type lectin receptor, aCLR）。通过5’-Race技术获得aTf全长cDNA序列（FM875933）,该cDNA序列全长2246个核苷酸,3’末端具有polyA尾,开放阅读框由693个氨基酸组成,编码蛋白分子量为75.9 kDa。序列分析表明,aTf（185-289）包括两个铁结合残基（Tyr197和His253）,位于aTf的N末端。酵母体内互作实验表明,全长aTf与aLECT2之间仍存在互作。缺失实验表明,aTf（185-289）区段和aLECT2信号肽都不参与两者间的互作。此外,其他物种,如大黄鱼、小鼠,LECT2和Tf之间也互作,而且同一物种之间互作,不同物种之间不互作。另据文献报道,Tf-LECT2的互作可能与机体抵御病原侵染有关。aCLR cDNA序列（FN396582）全长1265个核苷酸,3’末端具有polyA尾,开放阅读框编码一个由156个氨基酸组成的分子量为29.30 kDa的蛋白质,与大西洋鲑C-type lectin受体A基因同源性最高。酵母体内互作实验表明,全长aCLR与aLECT2之间仍存在互作。缺失实验结果表明,aCLR通过C型凝集素结构域（CTLD）与LECT2进行互作。由于鱼类CLR的CTLD与哺乳动物树突状细胞表面特异性表面特异性非整联蛋白受体（DC-SIGN）同源性很高。另据实验表明,小鼠DC-SIGN与LECT2之间也存在互作,这暗示血清中的LECT2可能会对膜表面的DC-SIGN产生影响。根据以上结果,我们推测香鱼CLR可能通过与LECT2互作,参与了LECT2趋化嗜中性粒细胞的信号转导途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 酵母双杂交在水产动物研究中的应用
• 1.1 酵母双杂交技术的原理
• 1.2 酵母双杂交的优缺点
• 1.2.1 特点与优点
• 1.2.2 酵母双杂交技术的局限性
• 1.3 酵母双杂交技术的应用
• 1.3.1 发现新蛋白或蛋白的新功能
• 1.3.2 灵敏地检测或验证蛋白－蛋白的相互作用
• 1.3.3 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点，寻找基因治疗中的多肽类药物
• 1.3.4 在蛋白质组学研究中的应用：可利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）
• 1.3.5 研究蛋白间发生相互作用的重要位点
• 1.4 酵母双杂交技术在水产动物研究中的应用
• 1.4.1 在水产动物免疫学研究中的应用
• 1.4.2 在水产动物生长发育研究中的应用
• 1.4.3 在水产动物生理功能研究中的应用
• 1.4.4 在水产动物病原与寄主互作研究中的应用
• 1.5 展望
• 2 材料与方法
• 2.1 试剂与仪器
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 材料
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 菌株与载体质粒
• 2.3 方法
• 2.3.1 LECT2 的克隆与测序
• 2.3.2 诱饵载体的构建
• 2.3.3 酵母cDNA 文库构建
• 2.3.4 筛选与pGBKT7-aLECT2 互作的蛋白
• 2.3.5 互作验证
• 3 香鱼LECT2 基因的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建、鉴定与表达
• 3.1 前言
• 3.2 结果
• 3.2.1 香鱼LECT2 基因cDNA 序列的获得
• 3.2.2 序列分析
• 3.2.3 香鱼LECT2 基因在各组织中的表达
• 3.2.4 酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-aLECT2 的构建
• 3.2.5 pGBKT7-aLECT2 在感受态酵母菌中的表达
• 3.2.6 pGBKT7-aLECT2 对酵母报告基因的自激活验证
• 3.2.7 DNA-BD/aLECT2 融合蛋白对酵母AH109 的毒性检测
• 3.3 讨论
• 4 香鱼LECT2 与Tf 之间的互作研究
• 4.1 前言
• 4.2 结果
• 4.2.1 应用酵母双杂交技术筛选与aLECT2 互作蛋白
• 4.2.2 鉴定aLECT2 和Tf 互作的结构域
• 4.3 讨论
• 5 香鱼C 型凝集素受体与LECT2 之间的互作研究
• 5.1 前言
• 5.2 结果
• 5.2.1 应用酵母双杂交技术筛选与aLECT2 互作的蛋白
• 5.2.2 鉴定aLECT2 和CLR 互作的结构域
• 5.3 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 在学研究成果
• 资助项目
• 致谢