基于高通量测序技术的小麦和紫茎泽兰基因组学初步研究

论文摘要

基因组是一个物种的所有遗传信息的总和。基因组学就是在基因组水平上研究一个物种的序列结构、基因功能、表达调控网络以及代谢途径，是研究生命现象本质的科学。由于基因组庞大和结构复杂，植物基因组学研究一直是基因组学研究的难点和挑战。新一代高通量测序技术的产生和发展为非模式植物基因组学研究带来了新的机遇和契机。本研究采用IlluminaSolexa测序技术，以两种的非模式植物小麦和紫茎泽兰为研究对象，对小麦的单条染色体臂（7DL）进行的探查测序，对紫茎泽兰的核基因组、叶转录组和叶绿体基因组进行了测序及序列分析，以期获得大量的序列信息，揭示它们的基因组结构和遗传特征，建立其基因组学研究的平台。主要研究结果如下:（1）小麦7D染色体长臂（7DL）的探查（Survey）测序与序列分析。首先，利用细胞流式仪分离小麦品种中国春7DL染色体的染色体DNA，然后利用Illumina Hiseq2000测序平台进行高通量测序，共产生了14.54Gb的数据，大约覆盖整个染色体臂40倍，利用短序列拼接软件Velvet进行De novo拼装，获得了160,021条大于200bp的contigs，总长达223Mb，覆盖了整个染色体臂65%；然后，对7DL上的功能基因进行了初步预测，共预测鉴定了各类重要的功能基因2,893个，其中2,573个能够被GO注释，这为7DL重要功能基因的克隆与功能研究提供重要的资源；进一步，采用生物信息学方法预测了编码20个miRNA家族的149个miRNA前体，并利用荧光定量PCR对随机挑选的5个miRNA在小麦不同组织中的表达量进行了分析，初步验证了预测结果的可靠性；最后，对拼接序列中的重复元件进行分析，预测了120,262转座子重复元件和16,325个微卫星重复元件，重复序列比例达84.8%，随机挑选了33个位点开发SSR标记并在20个小麦品种进行多态性验证，最终发现90%的引物能扩增，多态性标记达80%，利用缺体-四体检验发现18个标记是小麦7D所特异的，这为染色体特异分子标记的开发提供了一条新的思路。（2）原生地和入侵地紫茎泽兰叶转录组的de novo测序与比较分析。本研究利用Illumina GAIIx测序平台对原生地和入侵地紫茎泽兰的叶转录组进行了de novo测序，各测序了4G的数据量，混合所有数据进行序列拼装，共获得了127,189unigenes,这是作为紫茎泽兰平均基因长度为702bp;通过与nr等数据库比对，有53,886个Unigene能够被注释，占总Unigene数的42.37%；GO注释可以将41,481个Unigene注释到3大类65亚类的GO分类上，COG分析可以将17,498个Unigene注释到25种COG功能类型,主要功能包括细胞信号转导、次生物质生物合成、细胞代谢等；KEGG分析能把18,306个基因定位到297个代谢通路中，包括信号转导、物质代谢和次生代谢产物生物合成等。根据转录本表达丰度分析（RPKM值），共筛选出9,495条差异表达的基因（︱log2Ratio︱≥1且FDR≤0.001），这些基因可能与紫茎泽兰的入侵和适应进化相关，GO富集和KEGG富集分析发现他们的功能主要集中在次生代谢物生物合成和植物信号转导。（3）紫茎泽兰叶绿体基因组的测序与菊科叶绿体的比较基因组学分析。利用Illumina GAII测序平台对紫茎泽兰的叶绿体全基因组进行了测序。拼接获得了全长150,698bp的完整紫茎泽兰叶绿体基因组,这是第一个被测序的菊科泽兰属叶绿体基因组。它具有典型的真核生物叶绿体基因组结构，由一个长度为84,815bp的长单拷贝区（LSC），一个18,358bp的短单拷贝区（SSC）和一对长度为23,755bp的反向重复序列组成，共编码130个基因，其中蛋白编码基因86个，31个tRNA基因和4个rRNA基因，17个基因含有内含子。对紫茎泽兰叶绿体基因组中的重复元件进行预测，共鉴定出了31个串联重复元件和28离散重复元件,为叶绿体分子标记开发提供了重要资源。同时，利用本次测序的紫茎泽兰叶绿体基因组和公共数据库检索中收录的5个其他菊科叶绿体，在全基因组水平对菊科叶绿体的基因组成、序列差异和基因组结构等进行了比较基因组学分析，鉴定了5个（ndhD-ccsA, psbI-trnS, ndhF-ycf1, ndhI-ndhG和atpA-trnR）潜在的可用于菊科分子鉴定的叶绿体位点。最后，取33个叶绿体基因组中的35个基因组成序列矩阵，进行分子进化分析，发现紫茎泽兰与油菊的亲缘关系较近。（4）紫茎泽兰部分核基因组微卫星序列特征分析与SSR分子标记开发。利用高通量测序技术对紫茎泽兰总DNA进行了2倍覆盖度的探查测序，拼接获得了58,432个大于200bp的序列片段。利用这些序列对紫茎泽兰基因组微卫星序列的特征进行了分析，共鉴定到3,012个SSR位点，其中两碱基的重复是最丰富的重复类型；利用鉴定的SSR位点，开发了30个紫茎泽兰特异的SSR分子标记，并在24个材料中对标记的多态性进行了验证，结果发现，15对引物表现出多态性，等位位点数在2-5个，平均每个位点3个，遗传多样性指数（PIC）范围为0.08-0.59，平均值为0.30，期望杂合度（He）的范围为0.08-0.63，平均值为0.37；观测杂合度（Ho）的范围为0到1，平均值为0.44。本研究首次报道了紫茎泽兰的SSR分子标记，这些多态性标记将为紫茎泽兰的群体遗传学和分子生态学研究提供重要工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦基因组学研究进展
• 1.1.1 小麦遗传图谱的构建
• 1.1.2 小麦物理图谱构建
• 1.1.3 小麦基因组测序进展
• 1.1.4 小麦 7D 染色体长臂（7DL）研究进展
• 1.2 外来植物入侵与基因组学
• 1.2.1 外来植物入侵及其危害
• 1.2.2 入侵植物基因组学研究
• 1.2.3 紫茎泽兰研究进展
• 1.2.3.1 紫茎泽兰的生物学特性
• 1.2.3.2 紫茎泽兰的危害
• 1.2.3.3 紫茎泽兰的分子生物学研究进展
• 1.3 高通量测序技术
• 1.3.1 高通量测序技术的类型
• 1.3.1.1 Roche 454 测序技术
• 1.3.1.2 Illumina/Solexa 测序技术
• 1.3.1.3 SOLiD 测序技术
• 1.3.2 高通量测序技术在植物基因组学研究中的应用
• 1.3.2.1 在植物全基因组测序上的应用
• 1.3.2.2 在植物基因组重测序上的应用
• 1.3.2.3 在植物转录组测序上的应用
• 1.3.2.4 在植物小 RNA 测序方面的应用
• 1.3.2.5 在植物降解组测序上的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 小麦 7DL 染色体 DNA 的高通量 Survey 测序
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 7DL 染色体 DNA 的测序
• 2.1.3 基因预测与注释
• 2.1.4 7DL 重复序列的特征分析与特异分子标记开发
• 2.1.5 7DL miRNA 的预测与验证
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 测序及序列组装
• 2.2.2 基因预测与注释
• 2.2.3 7DL 的重复序列特征分析与标记开发
• 2.2.4 miRNA 的预测与验证
• 2.3 讨论
• 2.3.1 小麦 7DL 的 survey 测序
• 2.3.2 重复序列的基本特征
• 2.3.3 miRNA 的预测和验证
• 第三章 入侵植物紫茎泽兰转录组测序与分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 紫茎泽兰 RNA 的提取
• 3.1.3 转录组测序及序列组装
• 3.1.4 GO 注释与代谢途径分析
• 3.1.5 转录本表达丰度分析
• 3.1.6 不同样本间差异表达基因分析
• 3.1.7 部分差异表达基因的半定量 RT-PCR 分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 紫茎泽兰 RNA 提取及质量检测
• 3.2.2 测序及序列拼接
• 3.2.3 紫茎泽兰转录组基因功能注释与代谢途径分析
• 3.2.4 紫茎泽兰基因表达丰度的分析
• 3.2.5 入侵地和原生地差异表达基因的鉴定
• 3.2.6 部分差异表达基因的半定量 RT-PCR 分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 紫茎泽兰转录组的高通量 de novo 测序与序列组装
• 3.3.2 入侵地和原生地紫茎泽兰差异转录本的鉴定与分析
• 第四章 紫茎泽兰叶绿体基因组的测序与序列分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 紫茎泽兰叶绿体 DNA 的提取
• 4.1.3 叶绿体 DNA 的高通量测序
• 4.1.4 叶绿体基因组的拼接和补洞
• 4.1.5 叶绿体基因组的注释
• 4.1.6 重复序列的分析
• 4.1.7 菊科叶绿体基因组的比较分析
• 4.1.8 系统发育分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 紫茎泽兰叶绿体 DNA 提取质量
• 4.2.2 叶绿体 DNA 高通量测序及基因组组装
• 4.2.3 紫茎泽兰叶绿体基因组的基本特征
• 4.2.4 紫茎泽兰叶绿体基因组重复序列的分析
• 4.2.5 菊科叶绿体基因组的比较分析
• 4.2.6 物种亲缘关系的分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 紫茎泽兰叶绿体基因组的测序
• 4.3.2 菊科叶绿体的比较基因组学分析
• 第五章 紫茎泽兰部分核基因组微卫星序列特征分析与 SSR 分子标记开发
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 紫茎泽兰总 DNA 的提取
• 5.1.3 总 DNA 低覆盖度的 Solexa 测序与序列拼装
• 5.1.4 重复序列特征鉴定与 SSR 分子标记的开发
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 紫茎泽兰总 DNA 的测序及序列组装
• 5.2.2 紫茎泽兰 TE 原件的查找与分析
• 5.2.3 紫茎泽兰基因组微卫星序列特征分析
• 5.2.4 紫茎泽兰 SSR 分子标记的开发和验证
• 5.3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 个人简介