偏头痛痛觉机制—电刺激清醒大鼠上矢状窦区硬脑膜后三叉神经核尾侧复合体基因表达谱的实验研究

论文摘要

目的:1.观察电刺激清醒大鼠上矢状窦区硬脑膜后三叉神经核尾侧复合体基因表达谱的变化,寻找差异基因;2.利用实时定量PCR方法对与偏头痛病理生理关系密切的部分差异基因进行验证,探讨偏头痛痛觉发生的可能分子机制;3.利用western-blot技术对与偏头痛病理生理关系密切的AKAP5基因表达产物在模型中作进一步验证。方法:1.使用Affymetrix Cenome Rat 230 2.0寡核苷酸微阵列芯片对电刺激模型大鼠三叉神经核尾侧复合体基因差异表达进行研究。电刺激结束后快速将大鼠断头取出延髓及上颈段（至颈2）,抽提RNA,进行芯片杂交,清洗染色,将芯片放入基因芯片扫描仪3000进行扫描,使用GeneChipoperating software（GCOS）对扫描图像进行处理分析,获得数据。使用SAM软件进行处理筛选出差异基因;使用CB-MAS4.0生物分子功能注释系统（MAS）把挑选出的差异表达基因进行Pathway和GO的统计分析。2.采用实时定量PCR实验的方法对差异基因中的10个进行验证,使用生物信息学方法分析差异基因的功能。综合评价偏头痛痛觉的分子机制。3.体重为250克左右SD大鼠27只,随机分为a对照组（n=4）、b电刺激30分钟组（n=6）、c电刺激60分钟组（n=6）、d电刺激120分钟组（n=5）和e吗啡干预+电刺激120分钟组（n=6）,共5组。对照组不予刺激,其余各组电刺激不同时间,各组结束后立即断头取脑,取出延髓及上颈段（至颈2）,利用western-blot技术对AKAP5在三叉神经核尾侧复合体中的表达进行研究。结果:1.在全基因组31099个转录子（transcripts or probe sets）中,根据detection p-value＜0.05为“present”,对照组三叉神经核尾侧复合体共检测到21052.33±194.50个,占总数的67.69%,而电刺激组三叉神经核尾侧复合体共检测到20812.67±130.89个,占总数的66.92%。使用SAM软件分析,根据常规筛选标准:|Score（d）|≥1.5,同时Fold Change≥1.5或Fold Change≤0.67,相对于对照组,电刺激组三叉神经核尾侧复合体转录子表达显著变化的有44个,其中下调28个,上调16个（Changep-value＜0.05）。对上述差异基因进行功能分类,差异基因主要涉及维生素A代谢、细胞粘附点、细胞粘附分子、转运活动、电化学电位驱动转运蛋白活动、质膜必需组分、质膜固有组分、三羧酸循环、横纹肌收缩、色氨酸代谢、G蛋白信号、细胞周期、无机阴离子转运、激酶活动、肌动蛋白绑定、信号转导蛋白活动、脂质粘合、阴离子转运、脂肪生成、蛋白折叠、生长、细胞骨架蛋白粘附、酶抑制剂活动、神经系统发育、系统发育、辅酶代谢、细胞外基质、结合、细胞器膜、离子转运、转运蛋白活动、细胞粘附、胞内蛋白转运、细胞质、单价无机阳离子转运、胞外区、金属离子转运、代谢、氧化还原酶活动、线粒体、钠共输送体活动、输送体活动、神经递质转运等信号通路。2.虽然表达上调或下调的倍数存在差异,但芯片结果与实时定量PCR结果在上调或下调的趋势上基本一致。3.AKAP5在大鼠延髓及上颈髓中有表达,各组间表达无显著差异。结论:1.通过芯片分析,得到电刺激清醒大鼠上矢状窦区硬脑膜后的差异基因。差异基因涉及多种信号通路,其中转运活动、电化学电位驱动转运蛋白活动这两个通路的富集性相对较好,分别有三个基因表达发生了变化。而大部分基因都参与了两个以上的通路调控。2.与芯片结果相比,RT-PCR确证的10个基因变化趋势基本相同,证实了芯片杂交结果的可靠性。3.AKAP5在电刺激与对照组中的表达无显著差异,吗啡对AKAP5的表达无显著影响。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 电刺激清醒大鼠上矢状窦区硬脑膜后三叉神经核尾侧复合体基因表达谱分析
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 利用实时定量RT-PCR方法对基因芯片中部分差异基因进行验证并行生物信息学分析
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 AKAP5蛋白在电刺激清醒大鼠上矢状窦区硬脑膜后三叉神经核尾侧复合体的表达
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 文献综述
• 攻读学位期间发表文章
• 致谢