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slc26a6敲除和CFTR抑制对小鼠胰腺导管上皮细胞HCO3-分泌的影响

2020-12-11阅读(394)

slc26a6敲除和CFTR抑制对小鼠胰腺导管上皮细胞HCO3-分泌的影响

论文摘要

人类胰腺导管细胞以至少6倍浓度差逆向分泌HCO3-（～140mmol/L）,其对于机体具有非常重要的意义。为了探讨胰腺导管上皮细胞腔面膜侧HCO3-的转运机制,我们研究了小鼠离体胰腺导管上皮细胞腔面膜上slc26a6和CFTR的相关性,分析了slc26a6介导的细胞外Cl-和细胞内HCO3-的跨膜交换比例,并初步构想出人类胰腺导管分泌HCO3-的模型,为解释人类胰液中高浓度HCO3-分泌生理机制奠定理论基础,有利于进一步探讨CFTR相关疾病的发病机理。我们构建了slc26a6敲除小鼠和AF小鼠模型,运用显微解剖技术分离小鼠胰腺导管（直径～100μm）,并使用微灌流技术置换管腔内液体；BCECF为pH敏感的荧光探针,由荧光显微测定技术检测细胞内pH值变化,并计算出腔面膜侧HCO3-分泌率；我们还使用相对定量Real-Time PCR技术以p-actin作为内参基因检测目的基因CFTR的mRNA在slc26a6敲除型小鼠胰腺导管中的表达水平；最后,我们使用微电极检测了当胰腺导管管腔内灌注不同液体时上皮细胞跨膜电位的变化。结果发现,当野生型小鼠离体胰腺导管管腔内用标准HCO3-缓冲液微灌注时,CFTR特异性抑制剂CFTR inh-172(10μM明显加快（P<0.05）pHi值下降速度；slc26a6敲除型小鼠,pHi值从上皮细胞碱化后的恢复速率明显高于野生型小鼠的胰腺导管（P<0.05）,并且腔内加入CFTR inh-172后pHi值恢复速率明显下降；我们用高浓度HCO3-溶液微灌注野生型小鼠离体胰腺导管管腔时,腔内加入CFTR inh-172可明显抑制（P<0.05）腔面膜侧HCO3-分泌,而slc26a6敲除小鼠在相同实验条件下也得到相似结果；当我们向ΔF小鼠胰腺导管管腔内灌注高浓度Cl-溶液时,导管上皮细胞碱化后pHi值恢复速率与野生型小鼠无明显差异（P>0.05）；而ΔF小鼠胰腺导管内灌注高浓度HCO3-溶液时,导管上皮细胞碱化后的pHi值恢复速率明显低于野生型小鼠。相对定量Real-Time PCR实验结果证实slc26a6敲除对胰腺导管上皮细胞slc26a3和CFTR的表达水平无显著影响（P>0.05）。离体胰腺导管腔内用高浓度Cl-溶液微灌流,导管腔内加入H2DIDS （200μM）可导致野生型小鼠胰腺导管上皮细胞腔面膜发生可逆性的超极化,去除H2DIDS后恢复原来水平。与之相反,slc26a6敲除型小鼠胰腺导管上皮细胞跨膜电位无明显变化；另外,将管腔内液体由标准HCO3-缓冲液置换为Cl--freeHCO3-缓冲液时,发生瞬间去极化及持续超极化,而slc26a6敲除型小鼠,瞬间去极化之后并未发生超极化。总之,当小鼠胰腺导管腔内Cl-浓度较高时,胰管腔面膜上的CFTR和slc26a6存在一定的互补关系；当小鼠胰腺导管腔内HCO3-浓度较高时,CFTR提供了顶膜上HCO3-分泌的主要途径；胰腺导管上皮细胞腔面膜上slc26a6敲除对CFTR的增强作用可能并不是通过增加其表达水平实现的；我们的实验结果支持slc26a6介导细胞外Cl-和细胞内HCO3-的跨膜交换比例为1：2的理论。

论文目录

  • 内容提要
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第1章 文献综述
  • 1 概述
  • 3-的摄取'>2 胰腺导管上皮细胞基底膜对HCO3-的摄取
  • 3-的分泌'>3 CFTR和HCO3-的分泌
  • 3.1 CFTR的基本特点
  • 3-分泌'>3.2 CFTR与胰腺导管上皮细胞HCO3-分泌
  • 3-的动力'>4 胰腺导管上皮细胞腔面膜分泌HCO3-的动力
  • -/HCO3-交换'>5 胰腺导管细胞上Cl-/HCO3-交换
  • 6 胰腺导管细胞上的SLC26交换器
  • 7 SLC26交换器的产电性
  • 8 CFTR和SLC26交换器之间的相互关系
  • 9 关于slc26a6敲除小鼠的研究
  • 10 人类SLC26A6的特点
  • -—HCO3-交换体可提高腔内HCO3-浓度到何种程度'>11 产电的Cl-—HCO3-交换体可提高腔内HCO3-浓度到何种程度
  • 3-分泌机制的研究焦点'>12 关于胰腺导管上皮细胞HCO3-分泌机制的研究焦点
  • 13 本研究的创新性
  • 第2章 材料和方法
  • 1 动物
  • 1.1 slc26a6敲除小鼠模型
  • 1.2 ΔF小鼠模型
  • 2 小叶间导管的分离和培养
  • 2.1 消化
  • 2.2 清洗
  • 2.3 剥离胰腺导管
  • 2.4 培养
  • 3 胰腺导管微灌流胰腺及其上皮细胞内pH值的检测
  • 3.1 微灌流
  • 3.2 胰腺导管上皮细胞内的pH值的检测
  • 4 微灌流导管上皮细胞跨膜电位的检测
  • 4.1 微电极的制备
  • 4.2 穿刺
  • 5 液体
  • 5.1 HEPES buffer缓冲液
  • 3-缓冲液'>5.2 标准HCO3-缓冲液
  • 5.3 醋酸钠溶液
  • --free HCO3-缓冲液'>5.4 Cl--free HCO3-缓冲液
  • 3-缓冲液'>5.5 高浓度HCO3-缓冲液
  • 5.6 其他
  • 6 相对定量Real-Time PCR检测小鼠胰腺导管CFTR和slc26a3表达量
  • 6.1 RNA的提取
  • 6.2 纯化RNA产物
  • 6.3 RT-PCR cDNA合成
  • 6.4 相对定量Real-Time PCR
  • 7 数据统计与分析
  • 第3章 结果
  • 3-的影响'>1 slc26a6敲除和CFTR抑制对胰腺导管上皮细胞腔面膜分泌HCO3-的影响
  • -溶液'>1.1 胰腺导管腔内灌注高浓度Cl-溶液
  • 3-溶液'>1.2 胰腺导管腔内灌注高浓度HCO3-溶液
  • 3-分泌的影响'>2 ΔF小鼠胰腺导管内灌注不同离子浓度缓冲液对其腔面膜HCO3-分泌的影响
  • 3-溶液'>2.1 胰腺导管腔内灌注标准HCO3-溶液
  • 3-溶液'>2.2 胰腺导管腔内灌注高浓度HCO3-溶液
  • 2DIDS和Cl--free HCO3-缓冲液对于导管上皮细胞腔面膜跨膜电位的影响'>3 胰腺管腔内微灌注H2DIDS和Cl--free HCO3-缓冲液对于导管上皮细胞腔面膜跨膜电位的影响
  • 2DIDS对胰腺导管上皮细胞腔面膜跨膜电位的影响'>3.1 H2DIDS对胰腺导管上皮细胞腔面膜跨膜电位的影响
  • -对胰腺导管上皮细胞腔面膜跨膜电位的影响'>3.2 腔内灌流液去除Cl-对胰腺导管上皮细胞腔面膜跨膜电位的影响
  • 4 CFTR和slc26a3的mRNA在野生型和slc26a6敲除型小鼠胰腺导管中的相对含量
  • 4.1 重复性考察
  • 4.2 slc26a3表达的相对定量
  • 4.3 CFTR表达的相对定量
  • 第4章 讨论
  • 1 胰腺导管上皮细胞腔面膜上的CFTR和SLC26A6的相关性
  • 2 slc26a6敲除对胰腺导管上皮细胞slc26a3和CFTR的表达水平的影响
  • -和细胞内HCO3-的跨膜交换比例'>3 slc26a6介导的细胞外Cl-和细胞内HCO3-的跨膜交换比例
  • 3-分泌机制模型'>4 人类胰腺导管系统HCO3-分泌机制模型
  • 第5章 结论
  • 参考文献
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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