奶牛瘤胃微生物蛋白酶和二肽基肽酶Ⅳ基因的筛选与多样性分析

论文摘要

在日粮蛋白质的降解过程中，蛋白酶是蛋白质水解为肽或氨基酸的关键酶，由于受到纯培养技术的影响，瘤胃内分泌蛋白酶的细菌和各种蛋白酶的基因信息知之甚少。本试验旨在利用蛋白酶选择性培养基从瘤胃微生物Fosmid文库中筛选出含蛋白酶活性的克隆子，通过生物信息学分析获得这些克隆子的基因信息。应用脱脂乳粉和大豆蛋白粉两种蛋白酶选择性培养基，从30000个克隆中筛选得到14个具有蛋白酶活性的阳性克隆。利用福林酚试剂法检测14个蛋白酶克隆子的酶活力，结果表明每个克隆子分别具有不同的蛋白质分解能力。以酪蛋白为底物的克隆子酶活力介于0.59-2.74U/mg之间；以大豆蛋白粉为底物的克隆子酶活力在0.70-7.19U/mg之间。pro10F末端序列与金属肽酶匹配度为54%，属于肽酶M13家族，且该克隆蛋白酶最适pH值为7.0。选取两个克隆利用鸟枪测序法进行测序，经GenMark分析，共获得了53个不同的蛋白序列，其中有两个属于不同的肽酶家族的序列片段。为了研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidases Ⅳ，DPP-Ⅳ）的序列特征和酶学性质，从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中利用简并引物筛选含DPP-Ⅳ的阳性克隆。提取阳性克隆粗酶液，利用Gly-Pro-pNA底物检测肽酶活性。筛选后获得10个含有DPP-Ⅳ的阳性克隆（命名为DP1-DP10）。Fosmid末端序列经BLASTX比对后，结果表明78%的序列可以与数据库的已知序列相匹配，但相似度变化较大（44%-94%）。DPP-Ⅳ序列经BioEdit比对后，结果表明均含有N端保守区域（D-W-V-Y-E-E-E）和C端催化区域（G-W-S-Y-G-G）。酶活力检测发现DP7肽酶活力最高，为6.88U·mg-1。提取质粒等量混合后用Illumina HiSeq2000进行建库测序，经过Glimmer软件分析，获得3591个基因，对这些基因进行功能注释，发现参与多种代谢途径的基因，尤其是参与蛋白质降解过程的基因，其中存在两个不同的DPP-Ⅳ基因，为瘤胃蛋白质代谢的进一步研究提供了基础信息。选取10个阳性克隆中粗酶液活性最高的克隆DP7进行DPP-Ⅳ基因的研究。利用已有DP7中DPP-Ⅳ基因的序列两端设计引物，对DP7质粒进行直接测序，并对DPP-Ⅳ基因进行原核表达。结果发现DP7克隆中DPP-Ⅳ基因全长为2298bp，可编码756个氨基酸残基。利用预测的DPP-Ⅳ基因序列与GenBank数据库中的序列进行BLASTP比较，发现相似性最高的序列来源于Pontibacter sp的序列（46%），依次是Sphingobacterium sp（46%）、Solitalea canadensis（46%）、Marinilabilia sp（45%）和Cecembia lonarensi（s45%）。该序列具有DPP-Ⅳ三联体的催化结构（Ser633、Asp708和His740），且比其他的序列多了一段从422位到425位插入的氨基酸序列，说明该序列是一种新的DPP-Ⅳ基因序列。对该序列设计表达引物进行序列扩增，获得DPP-Ⅳ基因表达序列，经原核表达和纯化后，获得了DP7克隆中DPP-Ⅳ的目的蛋白，可继续进行DPP-Ⅳ酶学性质的研究。为了解豆粕降解菌中DPP-Ⅳ基因的序列结构多样性，本试验利用尼龙袋法分别收集0、12、24和48h豆粕降解菌，提取总DNA，PCR扩增16S rDNA V3区进行变性梯度凝胶电泳分析，结果表明与0h相比，12、24和48h的豆粕降解菌存在明显的变化，0h细菌的菌群条带比其他时间点的菌群条带丰富。选取12h的豆粕降解菌作为DPP-Ⅳ基因简并引物的扩增模板，PCR产物克隆测序后，获得5个克隆的DPP-Ⅳ基因序列；经BioEdit软件对序列进行比对，分析发现这5条序列存在DPP-Ⅳ的保守区序列（D-W-V-Y-E-E-E），但催化区（G-X-S-X-X-G）存在S→T或S→R的变异。对不同时间点的豆粕降解菌DNA混合样品进行DPP-Ⅳ全长基因的扩增，获得20个克隆的DPP-Ⅳ基因的全长序列。20个克隆中DPP-Ⅳ基因序列长度均为2193bp，都具有DPP-Ⅳ的活性位点序列（G-X-S-X-X-G）和催化三联体结构，但在保守序列（D-W-V-N-E-E-E）区出现2个变异位点（V→A和N→S）。这4个变化位点的存在是否影响DPP-Ⅳ的酶活性有待进一步研究。为了揭示体外培养条件下厌氧培养菌中DPP-Ⅳ基因多样性及莫能菌素对产生DPP-Ⅳ基因细菌的影响，本试验以酪蛋白为唯一氮源（P组），另一组在以酪蛋白为唯一氮源的基础上添加莫能菌素（M组），分别接种瘤胃液后，进行厌氧培养。培养12h后，收集培养液中的微生物，提取基因组DNA。利用设计的DPP-Ⅳ基因引物，通过PCR构建DPP-Ⅳ基因文库，挑取克隆测序后，获得66条DPP-Ⅳ基因序列；经Mothur软件分析发现23个OTU，其中OTU9可能是对莫能菌素敏感的蛋白降解菌的DPP-Ⅳ基因。对P和M组的厌氧培养菌进行DPP-Ⅳ基因的定量研究，发现P组的DPP-Ⅳ基因的拷贝数极显著高于M组（P<0.01）。这些结果表明莫能菌素影响了产DPP-Ⅳ细菌的数量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 微生物蛋白酶的研究
• 1.2.1.1 微生物蛋白酶的种类
• 1.2.1.2 丝氨酸蛋白酶
• 1.2.1.3 半胱氨酸蛋白酶
• 1.2.1.4 天冬氨酸蛋白酶
• 1.2.1.5 金属蛋白酶
• 1.2.1.6 肽酶
• 1.2.2 瘤胃微生物蛋白质降解和微生物合成之间的关系
• 1.2.2.1 细菌蛋白酶降解日粮蛋白成寡肽
• 1.2.2.2 细菌肽酶降解寡肽成氨基酸
• 1.2.2.3 细菌脱氨酶降解氨基酸成氨
• 1.2.2.4 细菌在非蛋白氮降解中的作用
• 1.2.3 元基因组学研究
• 1.2.3.1 功能驱动筛选法
• 1.2.3.2 序列驱动筛选法
• 1.2.3.3 瘤胃微生物的元基因组学筛选
• 1.3 研究内容
• 第二章 瘤胃微生物 Fosmid 文库蛋白酶阳性克隆的筛选与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 奶牛瘤胃 Fosmid 文库的构建
• 2.1.2 瘤胃 Fosmid 文库的复制
• 2.1.3 蛋白酶阳性克隆筛选与验证
• 2.1.3.1 蛋白酶选择性培养基的配制
• 2.1.3.2 蛋白酶阳性克隆筛选
• 2.1.4 阳性克隆蛋白酶活力测定
• 2.1.4.1 阳性克隆蛋白酶提取
• 2.1.4.2 阳性克隆蛋白酶活性测定
• 2.1.5 阳性克隆 Fosmid 末端序列测定
• 2.1.6 阳性克隆插入序列测序
• 2.1.6.1 阳性克隆的质粒提取
• 2.1.6.2 阳性克隆的插入序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 瘤胃 Fosmid 文库的复制结果
• 2.2.2 蛋白酶阳性克隆的筛选
• 2.2.2.1 脱脂乳粉培养基的筛选
• 2.2.2.2 大豆蛋白粉培养基的筛选
• 2.2.3 蛋白酶阳性克隆酶活性测定
• 2.2.4 蛋白酶阳性克隆的末端序列分析
• 2.2.5 阳性克隆插入片段的序列特征
• 2.3 讨论
• 2.3.1 蛋白酶阳性克隆的筛选
• 2.3.2 阳性克隆酶活性分析
• 2.3.3 阳性克隆末端序列的分析
• 2.3.4 阳性克隆插入序列的分析
• 2.4 结论
• 第三章 瘤胃微生物 Fosmid 文库中二肽基肽酶Ⅳ的筛选与分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 瘤胃微生物 Fosmid 文库筛选池的制备
• 3.1.2 Fosmid 文库混合质粒的提取
• 3.1.3 DPP-Ⅳ阳性克隆的序列性筛选
• 3.1.3.1 二级筛选池中 DPP-Ⅳ的 PCR 扩增
• 3.1.3.2 含 DPP-Ⅳ基因阳性克隆的追溯
• 3.1.3.3 阳性克隆的验证
• 3.1.4 阳性克隆的酶切鉴定
• 3.1.5 阳性克隆 Fosmid 末端序列测定
• 3.1.6 阳性克隆 DPP-Ⅳ基因的克隆和测序
• 3.1.7 阳性克隆混合质粒的高通量测序
• 3.1.8 阳性克隆肽酶活性测定
• 3.1.8.1 阳性克隆粗酶液的提取
• 3.1.8.2 阳性克隆肽酶活性测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 阳性克隆的序列性筛选
• 3.2.2 阳性克隆的酶切鉴定
• 3.2.3 阳性克隆的末端测序
• 3.2.4 DPP-Ⅳ序列的多样性分析
• 3.2.5 Fosmid 克隆中插入序列的分析
• 3.2.6 阳性克隆肽酶活性测定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 DPP-Ⅳ基因的混合质粒筛选
• 3.3.2 DPP-Ⅳ基因的序列分析
• 3.3.3 阳性克隆插入序列的分析
• 3.3.4 阳性克隆肽酶活性分析
• 3.4 结论
• 第四章 DP7 克隆中二肽基肽酶Ⅳ的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料来源
• 4.1.2 DPP-Ⅳ基因序列的获得和分析
• 4.1.2.1 DPP-Ⅳ基因序列的获得
• 4.1.2.2 DPP-Ⅳ序列的分析
• 4.1.3 DP7 中 DPP-Ⅳ的表达和纯化
• 4.1.3.1 DP7 中 DPP-Ⅳ表达序列扩增
• 4.1.3.2 DP7-DPP-Ⅳ克隆和 pET28a 载体的双酶切和连接
• 4.1.3.3 pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的诱导表达
• 4.1.3.4 pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的提取
• 4.1.3.5 pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的纯化
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 DPP-Ⅳ序列的分析
• 4.2.1.1 DPP-Ⅳ序列组成和理化性质
• 4.2.1.2 DPP-Ⅳ序列信号肽的预测与分析
• 4.2.1.3 DPP-Ⅳ序列跨膜结构的预测与分析
• 4.2.1.4 DPP-Ⅳ序列疏水性的预测与分析
• 4.2.1.5 DPP-Ⅳ序列保守结构域的预测与分析
• 4.2.1.6 DPP-Ⅳ序列的进化分析
• 4.2.2 DPP-Ⅳ基因的表达产物扩增
• 4.2.3 pET28a 载体和 DPP-Ⅳ基因表达产物的双酶切体系的建立
• 4.2.4 pET28a 载体和 DPP-Ⅳ基因表达产物的连接
• 4.2.5 pET28a-DPP-Ⅳ目的蛋白的表达与纯化
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 第五章 豆粕降解菌中二肽基肽酶Ⅳ的序列分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 样品采集
• 5.1.2 总 DNA 提取
• 5.1.3 16S rDNA V3 区域 PCR 扩增
• 5.1.4 变性梯度凝胶电泳
• 5.1.5 DPP-Ⅳ基因的 PCR 扩增
• 5.1.6 DPP-Ⅳ基因序列克隆和测序
• 5.1.7 DPP-Ⅳ基因的序列分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 不同时间点豆粕降解菌 DNA 提取
• 5.2.2 不同时间点豆粕降解菌 16S rDNA 的 PCR-DGGE 分析
• 5.2.3 DPP-Ⅳ基因部分序列的扩增和序列分析
• 5.2.4 DPP-Ⅳ全长基因的扩增和序列分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 豆粕收集菌的多样性分析
• 5.3.2 DPP-Ⅳ基因部分序列的分析
• 5.3.3 DPP-Ⅳ全长基因的序列分析
• 5.4 结论
• 第六章 体外培养条件下二肽基肽酶Ⅳ的序列分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 厌氧培养基的配制
• 6.1.2 厌氧菌的富集培养和样品采集
• 6.1.3 DPP-Ⅳ基因的扩增
• 6.1.4 DPP-Ⅳ基因的克隆、测序和分析
• 6.1.5 DPP-Ⅳ基因的定量分析
• 6.1.5.1 DPP-Ⅳ基因定量引物的设计和扩增
• 6.1.5.2 DPP-Ⅳ基因荧光定量标准品的制备
• 6.1.5.3 DPP-Ⅳ基因标准曲线的建立和样品检测
• 6.1.5.4 数据处理
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 厌氧培养样品中 DPP-Ⅳ基因的序列分析
• 6.2.2 厌氧培养样品中 DPP-Ⅳ基因的定量
• 6.2.2.1 DPP-Ⅳ基因定量引物的 PCR 扩增
• 6.2.2.2 DPP-Ⅳ基因标准品制备及标准曲线建立
• 6.2.2.3 厌氧培养样品中 DPP-Ⅳ基因的表达
• 6.3 讨论
• 6.4 结论
• 第七章 全文结论
• 7.1 全文结论
• 7.2 创新点
• 7.3 有待进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历