双重标记筛选木糖、葡萄糖共发酵高产乙醇酿酒酵母融合子

论文摘要

利用木质纤维素原料生产燃料乙醇已成为资源开发领域的研究热点。葡萄糖和木糖是木质纤维素水解液的主要糖分。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由于不具有完整的木糖代谢途径,因此只能代谢葡萄糖而不能代谢木糖,从而限制了其高效地利用木质纤维素类原料进行燃料乙醇的生产。通过原生质体融合技术可以对酿酒酵母进行改造从而获得能够代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株。然而,在原生质体融合过程中,融合子的筛选工作尤为重要,如何准确、迅速、简便地筛选出具有所需优良性状的融合子,是原生质体融合能否取得成功的一个重要环节。本文选择发酵性能优良的酿酒酵母W5和具有木糖代谢途径的休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)20335为出发菌株,通过原生质融合手段,疏通酿酒酵母木糖代谢流;并利用抗性标记及报告基因的双重标记,选育可以高效利用木糖、葡萄糖为混合碳源进行乙醇发酵,并使乙醇产量有所提高的酿酒酵母工程菌株。本试验中构建了两个附加体型质粒载体pZLY1和pZLY2。其中,质粒载体pZLY1大小为4949bp,含有G418抗性标记和报告基因GFP;质粒载体pZLY2大小为7713bp,含有Blasticidin抗性标记和报告基因gusA。通过醋酸锂转化法,分别将质粒载体pZLY1和pZLY2转化休哈塔假丝酵母20335和酿酒酵母W5,获得转化子。对二者的转化子进行原生质体融合,通过上述四种标记筛选原生质体融合子。最终筛选出10株融合株,其混合碳源乙醇得率均高于双亲株。其中,ZLYRHZ7的混合碳源乙醇得率最高,0.427g/g,比亲本株W5(乙醇得率0.311g/g)和20335(乙醇得率0.353g/g)分别提高了 37.3%和21.0%。本课题研究的成功,为原生质体融合子筛选方法的优化及酿酒酵母木糖代谢途径的改造提供了新的成功实例,为酿酒酵母的木糖代谢工程和木质纤维素的生物转化制取乙醇研究提供基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 木质纤维素燃料乙醇的生产及其意义
• 1.2 木质纤维素生产燃料乙醇菌种选育
• 1.2.1 木质纤维素生产燃料乙醇菌种选育的主要手段
• 1.2.2 原生质体融合技术在酿酒酵母工程菌构建中的应用
• 1.3 原生质体融合子的筛选方法
• 1.3.1 原生质体融合子筛选的常规方法
• 1.3.2 原生质体融合子筛选的分子生物学方法
• 1.4 本课题研究的目的及意义
• 1.4.1 本课题研究的背景、思路和目的
• 1.4.2 本课题研究的意义
• 1.5 本研究的主要技术路线
• 1.6 课题资助名称
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株及质粒载体
• 2.1.2 PCR扩增引物
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要生物化学及分子生物学试剂
• 2.1.5 主要生化试剂及缓冲液配制方法
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 ADHp、ADHt及Blasticidin抗性基因bsd的克隆与测序
• 2.2.2 报告基因gusA的获得
• 2.2.3 酿酒酵母表达载体pZLY1的构建
• 2.2.4 酿酒酵母表达载体pZLY2的构建
• 2.2.5 G418对休哈塔假丝酵母20335最低抑菌浓度的测定
• 2.2.6 Blasticidin对酿酒酵母W5最低抑菌浓度的测定
• 2.2.7 表达载体转化酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335
• 2.2.8 酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335转化子的筛选与鉴定
• 2.2.9 原生质体融合及融合子的检出
• 2.2.10 融合子质粒消除
• 2.2.11 双亲株及融合子木糖、葡萄糖单碳源发酵试验
• 2.2.12 双亲株及融合子木糖、葡萄糖混合碳源发酵试验
• 2.2.13 融合子发酵罐扩大培养发酵性能初探
• 第3章 结果与分析
• 3.1 ADHp、ADHt及Blasticidin抗性基因bsd的克隆与测序
• 3.1.1 ADHp的克隆与测
• 3.1.2 ADHt的克隆与测序
• 3.1.3 Blasticidin抗性基因bsd的克隆与测序
• 3.2 报告基因gusA的获得
• 3.2.1 质粒载体pBI121的获得
• 3.2.2 酶切获得gusA片段及胶回收纯化
• 3.3 酿酒酵母表达载体pZLY1的构建
• 3.3.1 pKT0150和pZLYT-ADHp的双酶切
• 3.3.2 重组质粒载体pZLY1阳性转化子的筛选与鉴定
• 3.4 酿酒酵母表达载体pZLY2的构建
• 3.4.1 载体pZLYA的构建
• 3.4.2 载体pZLYAB的构建
• 3.4.3 载体pZLY2的构建
• 3.5 G418对休哈塔假丝酵母20335最低抑菌浓度的测定
• 3.6 Blasticidin对酿酒酵母W5最低抑菌浓度的测定
• 3.7 酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335转化子筛选与鉴定
• 3.7.1 酿酒酵母W5转化子的筛选与鉴定
• 3.7.2 休哈塔假丝酵母20335转化子的筛选与鉴定
• 3.8 原生质体融合及融合子的检出与鉴定
• 3.8.1 原生质体融合子的检出
• 3.8.2 原生质体融合子的鉴定
• 3.9 融合子质粒消除
• 3.10 双亲株及融合子木糖、葡萄糖单碳源发酵试验
• 3.10.1 原生质体融合双亲株W5及20335单碳源发酵性能测定
• 3.10.2 原生质体融合子单碳源发酵性能测定
• 3.11 双亲株及融合子木糖、葡萄糖混合碳源发酵试验
• 3.11.1 原生质体融合双亲株W5及20335混合碳源发酵性能测定
• 3.11.2 原生质体融合子混合碳源发酵性能测定
• 3.12 融合子发酵罐扩大培养发酵性能初探
• 3.12.1 双亲株及融合子OD值和菌体干重关系曲线
• 3.12.2 双亲株及融合子发酵罐扩大培养试验
• 3.13 总结
• 第4章 讨论
• 4.1 酵母基因表达载体的种类及选择依据
• 4.2 可选用酵母菌筛选的报告基因种类
• 4.3 本试验原生质体融合子筛选方法与其他方法的比较
• 4.4 原生质体融合子的碳源利用及产醇
• 4.4.1 摇瓶水平原生质体融合子的碳源利用及产醇
• 4.4.2 发酵罐水平原生质体融合子的碳源利用及产醇
• 4.5 融合子特征进一步鉴定的方法
• 4.6 工作展望
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 附录6
• 附录7
• 附录8
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文