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一种新糖苷酶家族的A.tabescens β-甘露聚糖酶Man78基因克隆及序列分析的研究

2020-12-03阅读(582)

一种新糖苷酶家族的A.tabescens β-甘露聚糖酶Man78基因克隆及序列分析的研究

论文摘要

β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan mannohydrolase;Ec.3.2.1.78）,简称β—甘露聚糖酶（β-mannanase）,是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖的内切水解酶,它属于半纤维素酶类,广泛存在于动物、植物和微生物中。迄今,所报道的β—甘露聚糖酶均归属糖苷水解酶家族5和26。该酶已在饲料、食品、造纸、石油开采及生物质能等多方面有了广泛的应用。本研究通过诱导培养本实验室保藏菌种A.tabescens EJLY2098,且对其分泌的β—甘露聚糖酶Man78蛋白进行纯化,获得了电泳纯的β—甘露聚糖酶,利用MS/MS技术分析了其肽段氨基酸序列,并以此获得的肽段氨基酸序列设计简并引物,以基因组DNA为模板进行简并PCR,再通过SMART-RACE技术,获得β—甘露聚糖酶的末端cDNA序列,最后进行成熟肽PCR,获得全长cDNA序列。对获得的全长cDNA序列进行ORF分析,获得蛋白序列。然后对所获得的蛋白序列进行同源性、一级结构、二级结构、三级结构的生物信息学分析。经过分析发现,所获得的A.tabescensβ—甘露聚糖酶Man78与现已报道的属糖苷水解酶家族5和26的β—甘露聚糖酶没有同源性,存在氧化还原酶结构域,推测该酶属于一个新的糖苷水解酶家族。本研究的完成标志A.tabescens所产的两个组分的β—甘露聚糖酶的分离和基因的全长cDNA克隆全部完成。A.tabecscensβ—甘露聚糖酶Man78可能属一个新的糖苷水解酶家族,深入开展β—甘露聚糖酶Man78的研究对认识β—甘露聚糖酶有十分重要的意义。

论文目录

  • 目录
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略词表
  • 1 前言
  • 1.1 β-甘露聚糖酶的简介
  • 1.2 β-甘露聚糖酶的基因克隆
  • 1.3 β-甘露聚糖酶的基因表达
  • 1.4 β-甘露聚糖酶的应用及研究进展
  • 1.5 质谱技术及其在生命科学中的应用
  • 1.6 研究背景、思路和意义
  • 2 实验设备及材料
  • 2.1 主要仪器设备
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌种
  • 2.2.2 培养基
  • 2.2.3 试剂与母液配制
  • 2.2.4 酶类
  • 2.2.5 试剂盒
  • 2.2.6 其他
  • 3 实验方法
  • 3.1 β-甘露聚糖酶的活力测定
  • 3.2 蛋白质浓度测定
  • 3.3 β-甘露聚糖酶的分离和纯化
  • 3.4 β-甘露聚糖酶的质谱分析
  • 3.5 总RNA的提取
  • 3.6 RT-PCR
  • 3.6.1 简并引物设计
  • 3.6.2 RT-PCR步骤
  • 3.6.3 切胶回收PCR产物
  • 3.6.4 TA克隆
  • 3.6.5 测序
  • 3.6.6 RT-PCR条件摸索
  • 3.6.6.1 更换引物
  • 3.6.6.2 调整引物比例
  • 3.6.6.3 调整Mg2+浓度
  • 3.6.6.4 调整模板浓度
  • 3.6.6.5 退火温度摸索
  • 3.6.6.6 二次PCR及降落PCR
  • 3.7 基因组DNA提取
  • 3.8 简并引物PCR
  • 3.8.1 PCR步骤
  • 3.8.2 切胶回收PCR产物
  • 3.8.3 TA克隆
  • 3.8.4 测序
  • 3.9 SMART-5'RACE
  • 3.9.1 引物设计
  • 3.9.2 5'RACE-Ready cDNA的制备
  • 3.9.3 5'RACE步骤
  • 3.9.4 巢式PCR
  • 3.9.5 切胶回收5'RACE产物
  • 3.9.7 测序
  • 3.10 MART-3' RACE
  • 3.10.1 引物设计
  • 3.10.2 3'RACE-Ready cDNA的制备
  • 3.10.3 3'RACE步骤
  • 3.10.4 切胶回收3'RACE产物
  • 3.10.5 TA克隆
  • 3.10.6 测序
  • 3.11 成熟肽PCR
  • 3.12 拼接全长cDNA序列
  • 3.13 生物信息学分析
  • 4 实验结果
  • 4.1 β-甘露聚糖酶的分离和纯化
  • 4.2 β-甘露聚糖酶的质谱分析
  • 4.3 总RNA的提取
  • 4.4 RT-PCR
  • 4.4.1 RT-PCR产物的电泳检测
  • 4.4.2 pT双酶切鉴定
  • 4.4.3 RT-PCR产物的测序结果
  • 4.4.4 RT-PCR条件摸索
  • 4.4.4.1 RT-PCR产物的电泳检测
  • 4.4.4.2 pT1双酶切鉴定
  • 4.4.4.3 RT-PCR产物的测序结果
  • 4.5 基因组DNA提取的结果
  • 4.6 简并引物PCR
  • 4.6.1 PCR产物的电泳检测
  • 4.6.2 pT双酶切鉴定
  • 4.6.3 PCR产物的测序结果
  • 4.7 SMART-5'RACE结果
  • 4.7.1 5'RACE产物的电泳检测
  • 4.7.2 pT双酶切鉴定
  • 4.7.3 PCR产物的测序结果
  • 4.8 SMART-3'RACE结果
  • 4.8.1 3'RACE产物的电泳检测
  • 4.8.2 pT双酶切鉴定
  • 4.8.3 3'RACE产物的测序结果
  • 4.9 成熟肽PCR结果
  • 4.10 拼接全长cDNA序列
  • 4.11 生物信息学分析
  • 4.11.1 开放阅读框分析
  • 4.11.2 同源性分析
  • 4.11.3 一级结构分析
  • 4.11.4 二级结构和功能分析
  • 4.11.5 三级结构分析
  • 5 讨论
  • 5.1 利用肽段信息进行简并引物的设计
  • 5.2 RT-PCR条件的优化
  • 5.3 以基因组DNA为模板的简并PCR克隆新基因的尝试
  • 5.4 TAIL-PCR克隆新基因的5'和3'末端
  • 5.5 生物信息学分析
  • 小结和展望
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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