中药皂苷的抗糖尿病活性筛选和药效学研究

论文摘要

目的:建立以高血糖、氧化损伤、胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷为主要特征的大鼠2型糖尿病模型（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）,筛选11种中药总皂苷的抗氧化、清除自由基、抗糖基化、抑制α-淀粉酶和促进胰岛βTC3细胞分泌胰岛素的活性,活性最优的用于大鼠T2DM模型,观察其对氧化损伤和T2DM相关指标的影响,并对其化学成分进行分离纯化,对分离得到的化合物进行抗糖尿病（diabetes mellitus,DM）活性筛选。方法:1.总皂苷的药理活性筛选。常规方法提取中药总皂苷,并利用香草醛-硫酸比色法检测总皂苷的含量。通过检测11种中药总皂苷对ascorbate/Fe2+、过氧基异丙苯（cumine hydroperoxide,CHP）和CCl4/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）诱导的大鼠肝脏微粒体脂质过氧化的抑制程度来评价其抗氧化能力。通过检测总皂苷对2,2′-二苯基-1-苦肼基（2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH）自由基的清除率,评价总皂苷清除自由基的能力。通过特异性的δ-葡萄糖酸内酯（δ-gluconolactone,δ-Glu）实验、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）-葡萄糖实验和N-乙酰-甘氨酰-赖氨酸甲酯（N-acetyl-glycyl-lysine methyl ester, GK）-核糖实验比较中药总皂苷对不同阶段糖基化反应形成的抑制作用。通过检测麦芽糖的浓度评价中药总皂苷对α-淀粉酶的作用。通过检测胰岛βTC3细胞释放胰岛素的量评价中药总皂苷刺激胰岛β细胞释放胰岛素的活性。2.大鼠T2DM模型的复制。给予大鼠高脂高糖除抗氧化剂饲料联合小剂量多次注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）,诱导大鼠T2DM模型。公式计算胰岛素敏感指数判断胰岛素抵抗,胰腺灌流技术判断胰岛素分泌情况。3.楤木总皂苷对大鼠T2DM的药效学研究。分别按62.5mg/kg、125.0mg/kg和250.0mg/kg的剂量灌胃给予活性最优的总皂苷（一天一次）治疗T2DM大鼠30天,检测血清、肝脏、骨骼肌和脂肪组织的相关氧化损伤指标,取胰腺做病理学评价。4.楤木总皂苷中化学成分的分离及药理活性筛选。采用硅胶柱色谱和制备型高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）等分离技术,对活性最优的总皂苷的化学成分进行了分离纯化,借助波谱技术对分离到的化合物进行结构鉴定,并通过体外及大鼠活体组织实验模型对化合物的抗氧化、清除自由基、抗糖基化和促进胰岛βTC3细胞分泌胰岛素的活性进行筛选。结果:1.总皂苷的药理活性筛选。楤木中总皂苷的含量最高,约为45.93% （w/w）,本研究考察的11种中药总皂苷具有不同的药理活性,综合各方面因素评价,楤木总皂苷将作为重点药物进行进一步的分离鉴定。2.大鼠T2DM模型的复制。通过给予大鼠高脂高糖除抗氧化剂饲料,使其处于氧化应激状态,大鼠机体氧自由基生成增加,抗氧化能力减弱,脂质过氧化作用加强,导致胰岛素抵抗,再联合小剂量多次注射STZ,诱发了胰岛素分泌缺陷和高血糖。3.楤木总皂苷对大鼠T2DM的药效学研究。不同剂量的楤木总皂苷能不同程度地改善T2DM大鼠的氧化损伤情况,楤木总皂苷虽未能将T2DM大鼠的血糖降至正常水平,但是250.0mg/kg剂量的楤木总皂苷能使T2DM大鼠的血糖水平明显下降,与T2DM模型组相比有显著性差异（P<0.05）,形态学实验表明给予楤木总皂苷后,光镜下T2DM大鼠胰腺有逐步恢复的趋势,但是胰岛功能却没有明显的改善。4.楤木总皂苷中化学成分的分离及药理活性筛选。从楤木总皂苷中分离出了12个化合物,其中TA35在体外具有很强的抗糖基化和刺激胰岛βTC3细胞释放胰岛素的作用。结论:系统研究了11种临床常用的中药总皂苷的抗T2DM活性,综合各方面因素评价,楤木总皂苷可能是具有潜在应用价值的T2DM治疗药物;本研究复制的T2DM模型虽然还不能完全反映人类T2DM进展的复杂过程,但至少对氧化应激在T2DM发生发展中的作用有了进一步的认识;楤木总皂苷能改善T2DM大鼠的氧化损伤并具有一定的降糖作用,其对T2DM的治疗作用还需进一步探讨;从楤木总皂苷中分离出的化合物TA35在体外具有很强的抗糖基化和刺激胰岛βTC3细胞释放胰岛素的作用。通过本课题的研究,对氧化应激在T2DM发生发展中的作用有了更深入的认识,为筛选安全有效的T2DM治疗药物奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 T2DM的发病机理
• 1.1 胰岛素抵抗
• 1.2 胰岛素分泌缺陷
• 1.3 氧化应激与T2DM的关系
• 2 T2DM动物模型
• 2.1 实验性T2DM动物模型
• 2.2 自发性T2DM动物模型
• 2.3 转基因T2DM动物模型
• 3 T2DM的治疗药物
• 3.1 治疗T2DM的化学药物
• 3.2 治疗T2DM的天然药物
• 正文
• 实验一 总皂苷的药理活性筛选
• 1 材料
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 植物材料
• 1.3 实验动物和细胞
• 2 方法
• 2.1 中药提取
• 2.2 总皂苷含量测定
• 2.3 大鼠肝微粒体提取
• 2+诱导的脂质过氧化的抑制作用'>2.4 不同中药总皂苷对ascorbate/Fe²⁺诱导的脂质过氧化的抑制作用
• 2.5 不同中药总皂苷对CHP诱导的脂质过氧化的抑制作用
• 4/NADPH诱导的脂质过氧化的抑制作用'>2.6 不同中药总皂苷对CCl₄/NADPH诱导的脂质过氧化的抑制作用
• 2.7 不同中药总皂苷对自由基的清除作用
• 2.8 不同中药总皂苷对早期糖基化反应产物形成的抑制作用
• 2.9 不同中药总皂苷对AGEs形成的抑制作用Ⅰ
• 2.10 不同中药总皂苷对AGEs形成的抑制作用Ⅱ
• 2.11 不同中药总皂苷对α-淀粉酶的抑制作用
• 2.12 不同中药总皂苷刺激胰岛βTC3 细胞释放胰岛素的作用
• 2.13 统计分析
• 3 结果
• 3.1 总皂苷含量测定
• 3.2 不同中药总皂苷对大鼠肝脏微粒体脂质过氧化体系的抑制作用
• 3.3 不同中药总皂苷对自由基的清除作用
• 3.4 不同中药总皂苷对早期糖基化反应产物形成的抑制作用
• 3.5 不同中药总皂苷对AGEs形成的抑制作用Ⅰ
• 3.6 不同中药总皂苷对AGEs形成的抑制作用Ⅱ
• 3.7 不同中药总皂苷对α-淀粉酶的抑制作用
• 3.8 不同中药总皂苷刺激胰岛βTC3 细胞释放胰岛素的作用
• 4 讨论
• 实验二 大鼠T2DM模型的复制
• 1 材料
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 实验动物
• 2 方法
• 2.1 实验饲料配制
• 2.2 动物分组及处理
• 2.3 TBARS的测定
• 2.4 SOD活性的测定
• 2.5 AGEs的测定
• 2.6 血糖及血清胰岛素测定
• 2.7 静脉糖耐量实验
• 2.8 胰腺灌注
• 2.9 胰腺中胰岛素的提取
• 2.10 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 色谱定性分析结果
• 3.2 氧化损伤指标
• 3.3 血糖及血清胰岛素测定
• 3.4 静脉糖耐量实验
• 3.5 注射STZ四周后空腹血清胰岛素、血糖及ISI的变化
• 3.6 胰腺灌注
• 3.7 胰腺中胰岛素的提取
• 4 讨论
• 实验三 楤木总皂苷对大鼠T2DM的药效学研究
• 1 材料
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 实验动物
• 2 方法
• 2.1 动物分组与治疗
• 2.2 标本的采集及处理
• 2.3 氧化损伤指标、血糖及血清胰岛素的测定
• 2.4 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 氧化损伤指标
• 3.2 血糖及血清胰岛素
• 3.3 胰腺组织病理学
• 4 讨论
• 实验四 楤木化学成分的分离及药理活性筛选
• 1 材料
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 植物材料
• 1.3 实验动物和细胞
• 2 方法
• 2.1 楤木化学成分的提取分离
• 2.2 楤木化学成分的结构鉴定
• 2.3 楤木化学成分的活性实验
• 2.4 统计分析
• 3 结果
• 3.1 楤木化学成分的提取分离
• 3.2 楤木化学成分的结构鉴定
• 3.3 楤木化学成分的活性实验
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢