导读:本文包含了嗜酸热硫化叶菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:麦芽寡糖基海藻糖合成酶,高通量筛选体系,分子改造,酶活力
嗜酸热硫化叶菌论文文献综述
姚锴琳[1]（2018）在《分子改造提升嗜酸热硫化叶菌MTSase酶活力研究》一文中研究指出海藻糖是一种高度安全的非还原性二糖,对生物体或生物大分子具有良好的非特异性保护作用;也可以作为生物体的结构组成成分,参与某些微生物细胞壁的组成;同时,海藻糖又可作为碳源和能源物质。因此,海藻糖被广泛应用于医药、食品、化妆品和农业等领域。源于S.acidocaldarius ATCC 33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC 5.4.99.15)是以淀粉为原料生产海藻糖的关键酶之一,但是该酶存在酶活力较低的缺点,不利于工业化应用。为此,本研究构建了一种适合用于MTSase突变文库的高通量筛选方法,并在此基础上利用定向进化提高了源于S.acidocaldarius ATCC 33909 MTSase的酶活力。主要研究结果如下:(1)探究了不同底物浓度对高通量筛选方法的影响,建立了以0.2%(w/v)的麦芽糊精溶液作为底物的MTSase的高通量筛选体系;探究了构建MTSase突变文库的易错PCR体系,发现当PCR体系中Mn~(2+)和Mg~(2+)的终浓度分别为0.4 mmol?L~(-1)和5.0mmol?L~(-1),突变文库的突变频率最为合适;在此基础上,以MTSase的基因tre Y作为模板,进行易错PCR后,构建重组质粒pET-24a(+)-treY,导入E.coli BL21(DE3),构建MTSase突变文库。(2)基于构建的筛选体系对MTSase的突变文库进行第一轮筛选,获得3个酶活提高较为显着的突变体,分别是F-7、E-3和D-6,其摇瓶发酵酶活分别为50.64 U?mL~(-1)、40.51 U?mL~(-1)和41.22 U?mL~(-1),是野生型MTSase酶活的1.90、1.52、和1.54倍;同时,对野生型MTSase及各个突变体进行分离纯化和酶学定性,结果表明:突变体同野生型的最适pH均为6.0;在pH 5.5-9.0,突变体的稳定性同野生型相似;突变体同野生型MTSase的最适温度均在60-70℃,60℃的半衰期均在14 d以上;突变体同野生型MTSase相比,动力学常数(K_m和k_(cat))各有差异,对底物的催化效率均有所提高。(3)以第一轮筛选获得酶活最高且酶学性质没有明显改变的突变体F-7的基因作为模板,进行第二轮的定向进化,获得一个酶活提高的突变体D-4,其摇瓶发酵酶活为63.96 U?mL~(-1),是野生型的2.40倍;对突变体D-4进行分离纯化和酶学定性,结果表明:突变体D-4的最适pH为6.0;在pH 5.5-9.0条件下,突变体D-4的稳定性与野生型相似;最适温度为60℃;60℃的半衰期在14 d以上;同野生型相比,突变体D-4对底物的亲和性有所提高,其催化效率为野生型的2.33倍。(4)根据突变体基因序列分析结果结合定点突变技术,发现第284位和第439位是导致酶活提高的关键位点,当这两个位点的苯丙氨酸和苏氨酸分别突变为缬氨酸和丙氨酸后,其突变体的摇瓶发酵酶活分别是野生型MTSase的1.45倍和1.50倍。并通过分子对接和分子模拟对突变位点进行分析,酶活提高可能原因是疏水相互作用和极性相互作用的减弱,使得催化残基Asp443所在loop的柔性增强,有利于该残基与底物结合。(5)探究了突变体D-4同野生型MTSase 3.6 L发酵罐产酶情况的差异,结果表明:37℃恒温培养至OD_(600)达40时,调节温度至25℃,以0.1 g?L~(-1)?h~(-1)恒速流加乳糖进行诱导,诱导18 h,突变体D-4最高酶活为624.7 U?mL~(-1),而野生型MTSase为316.7 U?mL~(-1);同时,探究了两者以麦芽糊精作为底物制备海藻糖的差异,结果表明:加酶单位相同的情况下,两者的海藻糖转化率均为72.8%,结合3.6 L罐发酵情况,应用突变体D-4制备海藻糖,加酶体积仅为野生型的50%,成本更为低廉。(本文来源于《江南大学》期刊2018-06-01）
黄奇洪,马家兴,倪金凤,申玉龙[2]（2017）在《优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的表达与应用》一文中研究指出【目的】开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中进行高效表达的eCGP123(enhanced consensus green protein variant 123)荧光蛋白,并用作S.islandicus的细胞内蛋白定位工具。【方法】绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。本研究主要对eCGP123的基因根据S.islandicus密码子偏好性进行优化与合成,在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并研究其蛋白性质;通过在eCGP123的C末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白(包括E.coli来源的Fts Z和S.islandicus来源的Ups E、PCNA1和SiRe_1200等),构建eCGP123及其融合蛋白的表达菌株,用激光共聚焦显微镜分析eCGP123及其融合蛋白在E.coli和S.islandicus活细胞中的亚细胞定位。【结果】我们确认了在E.coli中表达并纯化密码子优化后的e CGP123具有与野生型绿色荧光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白FtsZ和Si Re_1200分别主要定位于E.coli和S.islandicus分裂细胞的中间;鞭毛组分蛋白Ups E呈点状均匀分布,可能定位于细胞膜上;DNA复制滑动夹亚基PCNA1呈区域性点状分布,暗示了DNA复制区域的位置。蛋白的亚细胞定位与预期结果基本吻合。【结论】绿色荧光蛋白e CGP123可以作为报告蛋白,应用于S.islandicus细胞的蛋白定位分析中,可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具,但需要进一步优化条件。(本文来源于《微生物学报》期刊2017年09期）
吴世雄[3]（2016）在《嗜酸热硫化叶菌MTSase和MTHase的异源表达及应用》一文中研究指出海藻糖是一种安全、可靠的非还原性二糖,广泛存在于自然界中。海藻糖性质稳定,对生物体或生物大分子具有优良的抗逆保护作用,这些独特的生物功能和理化性质,使其在医药、食品、农业等多种行业应用前景广阔。麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)是以淀粉为原料制备海藻糖的关键酶。本研究首先将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909的MTSase和MTHase在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组表达,考察了重组酶的酶学性质;进而对重组E.coli进行了3L罐发酵条件优化。首次将该酶在短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中进行了重组表达,在摇瓶发酵的基础上进行了3L罐放大试验。在此基础上,研究了不同酶转化条件对海藻糖转化率的影响。主要研究结果如下:(1)构建了重组表达S.acidocaldarius ATCC 33909 MTSase和MTHase的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-treY、E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-tre Z,研究了提高重组蛋白可溶性表达的不同方法和策略,构建基因工程菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY、E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treZ,发现将MTSase和MTHase分别与硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)进行融合表达时,融合酶Trx-MTSase和Trx-MTHase的酶活分别为41.0 U?m L-1和42.0 U?m L-1,分别为非融合表达时酶活力的1.7倍和4.0倍(MTSase 24.2 U?mL-1,MTHase 10.4 U?mL-1)。切除N-端Trx蛋白后,MTSase和MTHase酶活都不同程度的提高,分别为切除前的1.26倍和1.31倍,为非融合表达时酶活的2.1倍和5.2倍。(2)对重组酶进行分离纯化和酶学性质研究,结果表明:(1)MTSase、MTHase的最适温度均为75℃。MTSase和MTHase在60℃半衰期分别为6 d和8 d,在75℃半衰期分别为12 h和16 h。(2)MTSase和MTHase的最适pH分别为5.5和6.0,MTSase在pH 5.0-5.5相对酶活维持在96%以上,MTHase在pH 5.5-6.0相对酶活维持在95%以上;pH稳定性结果表明MTSase和MTHase pH稳定性基本一致,均为pH 5.0-9.5。(3)对重组菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY、E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treZ 3L罐发酵诱导条件进行优化,结果表明:(1)在重组菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY发酵过程中,以30℃恒温培养,OD600达到40时,以流速0.4 g?L-1?h-1恒速流加乳糖进行诱导,诱导24 h,重组酶MTSase酶活最高达到229.0U·m L-1,约为摇瓶发酵酶活的5.6倍;(2)在重组菌E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treZ发酵过程中,以30℃恒温培养,OD600达到40时,以流速0.2 g?L-1?h-1恒速流加乳糖进行诱导,诱导24 h,重组酶MTHase酶活最高达到204.0 U·m L-1,约为摇瓶发酵的4.9倍。(4)首次将S.acidocaldarius ATCC 33909 MTSase和MTHase在B.brevis中进行了重组表达,构建基因工程菌B.brevis/pSVN-treY和B.brevis/pSVN-tre Z。重组菌在TM培养基中30℃摇瓶发酵60 h,胞内酶活力分别达到MTSase 16.3 U?m L-1、MTHase 7.8U?m L-1。重组菌3 L罐放大培养,MTSase和MTHase酶活分别达到66.0 U?m L-1和36.0U?m L-1,分别为摇瓶的4.0倍和4.6倍。(5)对重组MTSase和MTHase制备海藻糖工艺进行了研究,确定了实验室条件下双酶法生产海藻糖的最佳条件:以10%(w/v)马铃薯淀粉为底物,酶转化温度为60℃,pH 5.5,加酶量为MTSase 80 U?g-1淀粉、MTHase 20 U?g-1淀粉和普鲁兰酶5 U?g-1淀粉,反应48 h,海藻糖转化率达到最高为78.8%。底物浓度为25%时,海藻糖转化率为74.2%,产量为185.5g?L-1;底物浓度为30%时,海藻糖转化率只有68.4%,但产量达到最高的205.2 g?L-1。因此从工业生产角度考虑,选择底物浓度为25%-30%时为最佳。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
韩剑,陈波,戴欣,洪伟,季秀玲[4]（2010）在《云南腾冲热泉极端嗜酸热硫化叶菌多样性研究》一文中研究指出硫化叶菌(Sulfolobus)是极端嗜热古菌遗传机制研究的重要模式菌株,广泛分布于酸性热泉中.对分离自云南腾冲酸性热泉的11株极端嗜酸热菌株进行16S rRNA基因序列测定,并通过菌体形态观察、16S rRNA基因可变区序列比较、菌株16S rRNA基因相似性比较及系统发育分析,研究腾冲热泉硫化叶菌的多样性.结果表明,分离自腾冲热泉的11株硫化叶菌的16S rRNA基因序列与分离自世界上其它地区的8个硫化叶菌的标准菌株的相似性为85.8%～94.9%,与同样分离自腾冲热泉的S.tengchongensis标准菌株的相似性为96.6%～97.5%,在分类学上具有形成新种的可能.在16S rRNA基因高可变区序列上,与分离自世界上其它地区的8个硫化叶菌的标准菌株存在明显的差异.系统发育分析表明,分离自腾冲热泉的硫化叶菌在系统发育树上形成两个亲缘关系较为紧密的簇群,可见腾冲热泉硫化叶菌不仅具有一定的多样性,同时具有较明显的地域性特征.(本文来源于《应用与环境生物学报》期刊2010年05期）
陈波,魏云林,井申荣,季秀玲,陆月情[5]（2008）在《腾冲热海一株嗜酸热硫化叶菌的分离与鉴定》一文中研究指出从云南腾冲热海酸性温泉中分离纯化出一株极端嗜酸热菌株K4-1,并对其进行形态观察、生长特征、碳源和能源利用及16S rRNA基因分析。该菌株细胞形态为不规则球形,有单生鞭毛,严格好氧,兼性自养,能利用元素硫作为能源,也能利用酵母膏、精氨酸或核糖作为碳源和能源。其最适生长温度为75°C,最适pH为3.5。通过16S rRNA基因序列相似性对比对该菌株进行鉴定,结果表明该菌株与硫化叶菌属标准菌株的相似性介于86.6%~94.3%之间,与分离自腾冲热海的腾冲硫化叶菌Sulfolobus tengchongensis RT8-4菌株序列相似性最高,达到98.9%,可将菌株K4-1鉴定为硫化叶菌属菌株。菌株K4-1的16SrRNA基因序列号为EU729124。(本文来源于《微生物学通报》期刊2008年12期）
彭文舫[6]（2008）在《嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius基因敲除体系的构建》一文中研究指出极端嗜热古菌硫化叶菌属是古菌中最好的研究材料之一,但是其有效的基因敲除系统还有待构建和发展。这个问题一直阻碍着该模式生物更深一步的遗传学研究。本研究的目的是以古菌模式种Sulfolobus acidocaldarius为出发菌株,构建一套基因敲除体系。对于S. acidocaldarius,目前已经有一种有效的选择标记用于筛选其pyrEF缺失突变株,因此,我们希望构建其pyrEF缺失突变株,并作为宿主菌去检测pyrEF互补的遗传表达,检测pyrEF是否可以作为一种选择标记用于该模式古菌的基因敲除分析。本研究通过遗传重组方式构建pyrEF突变株,而E. coli载体pUC19用于构建基因敲除质粒。以S. acidocaldarius基因组DNA为模板扩增pyrEF同源臂,并将以上DNA片段插入到pUC19,得到pyrEF敲除质粒pEFD。用pEFD转化S. acidocaldarius,在涂有5-FOA平板上长出抗5-FOA的pyrEF突变株转化子。在挑取的121个转化子中,有一个pyrEF基因缺失963-bp的突变株,其突变等位基因pyrE上保留122-bp序列,在pyrF上保留155-bp。该突变株被命名为DEF-963,作为宿主菌用于检测遗传体系。为了检测pyrEF Marker在基因敲除突变株中的有效性,本研究通过“Markerless”基因缺失实验将DEF-963基因组中的bgaS基因缺失掉。Marker基因以S. solfatarius基因组DNA为模板通过PCR扩增得到,bgaS同源臂以S. acidocaldarius基因组DNA为模板PCR扩增得到,将以上所有片段插入到pUC19,得到bgaS基因敲除质粒pSD。用pSD转化DEF-963,转化子在缺少尿嘧啶的平板上形成菌落,而DEF-963则不能长出。挑取4个转化子抽提总DNA,用PCR进行检测,其中有2个在突变的bgaS等位基因处呈现出期望的条带大小,这样,就得到了pyrEF、bgaS双缺失突变株。为了验证该突变株,将该突变株基因组进行了Southern杂交分析,只有预期的突变基因的等位基因才能被探针杂交上。结果显示,得到的突变株确实为pyrEF、bgaS双缺失突变株。本系统应用,需要构建目的基因敲除载体。该载体中需在要敲除目的基因两侧加入S. solfataricus基因组中的pyrEF和lacS基因序列,进行转化后,将细胞置于不含尿嘧啶和以乳糖为唯一碳源的选择培养基上培养。只有发生了双交换, S. solfataricus中的pyrEF和lacS互补序列整合到DEF-964基因组中形成功能互补,转化子才可以编码合成尿嘧啶所需的酶,并通过互补的lacS基因编码产物β-半乳糖苷酶分解、利用乳糖,从而分别在尿嘧啶和乳糖选择培养基上生长。这样,对目的菌株的筛选是通过一个双重的筛选过程,使筛选能快速而又准确地进行。另外,到目前为止,所有的报导仅限于用一种选择标记对硫化叶菌的突变株进行筛选,但是很多遗传分析要求两种选择标记。因此,本研究构建的硫化叶菌双选择标记基因敲除系统就会显示出明显的优势。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2008-06-01）
王辉,陈炜,吴襟,金城[7]（2001）在《嗜酸热硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆和表达》一文中研究指出The gene of MTSase (maltooligosyltrehalose synthase) from %Sulfolobus acidocaldarius% ATCC49426 was amplified by PCR.The primers were designed according to the published sequence of homologous gene from %Sulfolobus acidocaldarius %ATCC33909.This gene was inserted into the plasmid pBV220 and the resultant recombinant plasmid pBV220|GT was transformed to %E.coli% DH5α.The activity of recombinant enzyme was about 10u/g(wet cell).In order to improve the expression level of target protein,some nucleotides in the 3′ and 5′ of the gene were modified to optimize the second structure of mRNA by PCR amplification using the new primers devised according to the biosoftware GOLDKEY2.0.As a result,the activity of recombinant enzyme increase to 19.8u/g(wet cell).Then,the helping plasmid pUBS520 which carried the gene encoding the tRNA of rare codons AGG and AGA was transformed to the recombinant strain.But it took little effect.(本文来源于《生物工程学报》期刊2001年03期）
王辉,陈炜[8]（1999）在《嗜酸热硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达》一文中研究指出海藻糖(Trehaloe)是由两个葡萄糖残基由a-1,1糖苷键相连的非还原性二糖,有非常独特的生物学性质,可以保护蛋白质、生物膜等免受干旱、冷冻及渗透压变化造成的危害,可用作多种药品、生物制品、活菌制剂的稳定剂和保护剂。工业化海藻糖主要来源于酵母,成本高,售价昂贵,(本文来源于《面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）》期刊1999-10-18）
嗜酸热硫化叶菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【目的】开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中进行高效表达的eCGP123(enhanced consensus green protein variant 123)荧光蛋白,并用作S.islandicus的细胞内蛋白定位工具。【方法】绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。本研究主要对eCGP123的基因根据S.islandicus密码子偏好性进行优化与合成,在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并研究其蛋白性质;通过在eCGP123的C末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白(包括E.coli来源的Fts Z和S.islandicus来源的Ups E、PCNA1和SiRe_1200等),构建eCGP123及其融合蛋白的表达菌株,用激光共聚焦显微镜分析eCGP123及其融合蛋白在E.coli和S.islandicus活细胞中的亚细胞定位。【结果】我们确认了在E.coli中表达并纯化密码子优化后的e CGP123具有与野生型绿色荧光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白FtsZ和Si Re_1200分别主要定位于E.coli和S.islandicus分裂细胞的中间;鞭毛组分蛋白Ups E呈点状均匀分布,可能定位于细胞膜上;DNA复制滑动夹亚基PCNA1呈区域性点状分布,暗示了DNA复制区域的位置。蛋白的亚细胞定位与预期结果基本吻合。【结论】绿色荧光蛋白e CGP123可以作为报告蛋白,应用于S.islandicus细胞的蛋白定位分析中,可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具,但需要进一步优化条件。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
嗜酸热硫化叶菌论文参考文献
[1].姚锴琳.分子改造提升嗜酸热硫化叶菌MTSase酶活力研究[D].江南大学.2018
[2].黄奇洪,马家兴,倪金凤,申玉龙.优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的表达与应用[J].微生物学报.2017
[3].吴世雄.嗜酸热硫化叶菌MTSase和MTHase的异源表达及应用[D].江南大学.2016
[4].韩剑,陈波,戴欣,洪伟,季秀玲.云南腾冲热泉极端嗜酸热硫化叶菌多样性研究[J].应用与环境生物学报.2010
[5].陈波,魏云林,井申荣,季秀玲,陆月情.腾冲热海一株嗜酸热硫化叶菌的分离与鉴定[J].微生物学通报.2008
[6].彭文舫.嗜酸热硫化叶菌Sulfolobusacidocaldarius基因敲除体系的构建[D].中国农业科学院.2008
[7].王辉,陈炜,吴襟,金城.嗜酸热硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆和表达[J].生物工程学报.2001
[8].王辉,陈炜.嗜酸热硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达[C].面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）.1999
标签：麦芽寡糖基海藻糖合成酶; 高通量筛选体系; 分子改造; 酶活力;