利用甘油发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的构建

论文摘要

近年来石化能源的日渐枯遏引发了人们对新型、可再生能源的深刻思考。生物柴油作为乙醇之后的第二个有望得到大规模推广应用的生物能源产品,备受国内外各界的青睐。目前主要通过酯交换法生产生物柴油,在生产过程中产生了大量的副产物——粗甘油废液。如何合理利用粗甘油废液,是这一产业面临的新问题,寻求粗甘油利用的新途径已引起人们的普遍关注。本文从上述两个方面考虑,探索一条利用生物柴油废液发酵3-羟基丙酸的生产途径,不仅可解决生物柴油生产过程中大量副产物甘油的再利用问题,也有望为生物发酵生产3-羟基丙酸找到另一种新途径。本论文研究的主要内容是利用基因工程手段构建以甘油为底物发酵产3-羟基丙酸的基因工程菌,构建基因工程菌涉及到两个关键酶,即甘油脱水酶（DHAB）和乙醛脱氢酶（ALDH）,甘油首先在甘油脱水酶作用下,脱水转化成3-羟基丙醛（3-HPA）,然后在乙醛脱氢酶的氧化作用下生成3-羟基丙酸（3-HP）。本研究首先利用PCR方法从酿酒酵母中克隆到1.9 kb的乙醛脱氢酶的编码基因ALDH及来源于克雷伯氏菌2.7 kb的甘油脱水酶的编码基因DHAB,构建了重组菌E.coli JM109（pUCtac-aldh）和E.coli JM109 （pEtac-dhaB）。对重组菌的表达酶活力研究表明:该菌株在37℃下,以1.0 mmol/L IPTG诱导5 h乙醛脱氢酶活力可达32.6 U/mg蛋白,甘油脱水酶活力达到3.3 U/mg蛋白。将两种重组质粒共转化大肠杆菌E.coli JM 109得到重组大肠杆菌E.coli JM109 （pUCtac-aldh,pEtac-dhaB）。对重组菌E.coli JM109、E.coli JM109 （pUCtac-aldh）、E.coli JM109 （pEtac-dhaB）、E.coli JM109 （pUCtac-aldh,pEtac-dhaB）进行发酵实验,初步考察该菌利用甘油进行好氧发酵生产3-羟基丙酸的性能。结果表明,E.coli JM109只有同时引入DHAB编码基因和ALDH编码基因时才能利用甘油转化为3-羟基丙酸。在含甘油50 g/L的发酵培养基中,重组菌E.coli JM109（pUCtac-aldh,pEtac- dhaB）经IPTG诱导后的3-羟基丙酸产量可达4.92 g/L,培养基中甘油转化率为50.12%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 3-羟基丙酸的性质及应用领域
• 1.2 3-羟基丙酸的市场情况
• 1.3 生物柴油副产物粗甘油与3-羟基丙酸生产
• 1.4 3-羟基丙酸的化学生产方法
• 1.5 3-羟基丙酸的生物合成方法
• 1.5.1 甘油的代谢途径
• 1.5.2 葡萄糖代谢产3-羟基丙酸的途径
• 1.6 生产菌种
• 1.7 甘油代谢产3-羟基丙酸途径的关键酶
• 1.7.1 甘油脱水酶
• 1.7.2 乙醛脱氢酶
• 1.8 微生物发酵3-羟基丙酸的研究进展
• 1.9 基因工程菌发酵3-羟基丙酸的研究进展
• 1.10 立题意义
• 1.11 研究内容
• 第二章酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要生化和分子生物学试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 酿酒酵母总DNA 的提取
• 2.1.7 PCR 反应
• 2.1.8 质粒pUCtac 和质粒pEtac 的提取
• 2.1.9 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.10 割胶回收DNA 片段
• 2.1.11 重组表达载体的构建
• 2.1.12 蛋白质含量的测定
• 2.1.13 乙醛脱氢酶（ALDH）活力的测定
• 2.1.14 温度和pH 对酶活力的影响
• 2.1.15 ALDH 在大肠杆菌JM109 中表达
• 2.1.16 重组菌 E.coli JM109 （pEtac-aldh）、E.coli JM109 （pUCtac-aldh）质粒稳定性分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 酿酒酵母总DNA 的提取
• 2.2.2 PCR 克隆乙醛脱氢酶的基因片段
• 2.2.3 重组质粒pUCtac-aldh、pEtac-aldh 的构建
• 2.2.4 重组质粒稳定性分析
• 2.2.5 重组菌乙醛脱氢酶酶活的测定
• 2.2.6 重组菌乙醛脱氢酶酶学性质的初步研究
• 2.2.7 蛋白含量的测定
• 2.2.8 SDS-PAGE 蛋白电泳分析
• 2.3 本章小结
• 第三章克雷伯氏菌甘油脱水酶的克隆与表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要生化和分子生物学试剂
• 3.1.4 主要仪器和设备
• 3.1.5 引物设计
• 3.1.6 液体培养
• 3.1.7 肺炎克雷伯氏菌细菌总DNA 的提取
• 3.1.8 PCR 克隆甘油脱水酶（DHAB）的DNA 片段
• 3.1.9 质粒pEtac 的提取
• 3.1.10 琼脂糖凝胶电泳
• 3.1.11 割胶回收DNA 片段
• 3.1.12 重组表达载体的构建
• 3.1.13 蛋白质含量的测定
• 3.1.14 甘油脱水酶（DHAB）活力的测定
• 3.1.15 DHAB 在大肠杆菌JM109 中表达
• 3.1.16 重组大肠杆菌JM109 （pEtac-dhaB）质粒稳定性分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 克雷伯氏菌总DNA 的提取
• 3.2.2 PCR 克隆甘油脱水酶的基因片段
• 3.2.3 重组质粒pEtac-dhaB 的构建
• 3.2.4 重组质粒稳定性分析
• 3.2.5 重组菌甘油脱水酶酶活的测定
• 3.2.6 蛋白含量的测定
• 3.2.7 SDS-PAGE 蛋白电泳分析
• 3.3 本章小结
• 第四章共表达基因工程菌利用甘油发酵产3-羟基丙酸
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 工具酶和试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 重组大肠杆菌JM109 （pEtac-dhaB,pUCtac-aldh）的构建
• 4.1.6 蛋白质含量的测定
• 4.1.7 重组菌甘油脱水酶和乙醛脱氢酶酶活力的测定
• 4.1.8 重组菌甘油脱水酶和乙醛脱氢酶在大肠杆菌E.coli JM109中表达
• 4.1.9 重组大肠杆菌E.coli JM109 （pEtac-dhaB,pUCtac-aldh）稳定性分析
• 4.1.10 重组菌发酵试验
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 共表达质粒的构建以及重组质粒稳定性分析
• 4.2.2 重组质粒酶活力测定
• 4.2.3 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 4.2.4 重组菌生长曲线的测定
• 4.2.5 HPLC 测定甘油标准曲线的绘制
• 4.2.6 重组菌初步发酵产3-羟基丙酸的实验
• 4.2.7 初始甘油浓度对重组菌发酵的影响
• 4.2.8 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响
• 4.2.9 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响
• 12浓度对重组菌发酵的影响'>4.2.10 维生素B₁₂浓度对重组菌发酵的影响
• 4.2.11 接种量的影响
• 4.2.12 IPTG对发酵的影响
• 4.3 本章小结
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文