拟南芥AtCTPA1基因的分子刻画及功能研究

论文摘要

光系统Ⅱ（PhotosystemⅡ,PSII）是嵌入在类囊体膜上的一个多亚基色素蛋白质复合物,在光合作用中催化光驱动的水氧化和质体醌还原。在高等植物中PSII由超过25个内在和外周蛋白质亚基组装而成,其中PSII反应中心复合物由D1,D2,细胞色素b559的a和β亚基以及PsbI组成。D1和D2形成的异二聚体构成了PSII结构的核心,其上结合了PSII电子传递所需的全部关键氧化还原成分。PSII在进行原初光能转换和电荷分离过程中不可避免地会遭受光的损伤破坏,其中反应中心蛋白D1是PSII光破坏损伤的主要目标。光合生物在漫长的进化过程中形成了一个高效的修复体系来维持PSII的正常功能。受损的D1蛋白被叶绿体内的蛋白酶系降解,随之由一个新合成的D1蛋白来替换。高等植物中反应中心蛋白D1是以前体的形式合成,在其C末端带有一个由9个氨基酸残基组成的延伸片段,在PSII组装成功能完备的复合物前,这个C末端延伸需要被D1碳末端加工酶（C-terminal processing protease of D1,CtpA）切除,这一过程对PSII的生物发生和损伤修复都非常重要。我们利用反式遗传学策略刻画了一个T-DNA插入失活的拟南芥CtpA同源物突变株系atctpa1,通过一系列生理生化和分子生物学鉴定我们分析了该突变体的光合特性和光合膜蛋白组成,研究了AtCTPA1基因在拟南芥中的生理功能。免疫印迹检测发现AtCTPA1基因编码了一个～47kDa的类囊体腔侧可溶蛋白,T-DNA的插入中断了atctpa1突变体中AtCTPA1的表达。在正常生长光强下AtCTPA1功能缺失不影响拟南芥的生长发育,突变体植株具有正常的生长速率和色素组成,叶绿素荧光特性和光合放氧活性测量结果说明其光合活性没有变化,类囊体膜主要色素蛋白复合物的组装和组成亚基的含量都与野生型相同。然而在强光下AtCTPA1基因缺失严重影响拟南芥的生长适宜度,突变体对强光的敏感度增强,生长受到显著抑制。通过光抑制和光恢复研究发现AtCTPA1基因影响拟南芥PSⅡ在强光下的快速修复。光抑制条件下突变体叶片的PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm下降加速,PSⅡ活性恢复进程减缓。与相比,叶绿体蛋白质合成抑制剂林可霉素预孵育处理没有造成野生型和atctpal突变体叶片间光抑制程度的差异。进一步检测光抑制不同时相叶片中PSⅡ反应中心蛋白D1含量的变化,我们发现AtCTPA1影响了拟南芥PSⅡ反应中心蛋白D1在强光下的周转。与野生型相比,atctpal突变体在光抑制进程中反应中心蛋白D1含量的下降速率加快,而林可霉素处理后野生型和atctpal突变体中D1降解的程度相当。上述实验结果证明AtCTPA1基因参与了拟南芥PSⅡ在强光下的高效修复,影响了强光下PSⅡ反应中心蛋白D1的周转。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• Abstract
• 1.研究背景综述
• 1.1 叶绿体是光合作用的主要场所
• 1.1.1 叶绿体的结构
• 1.1.2 叶绿体生物发生的核质协同控制
• 1.1.3 类囊体膜上的光合电子传递过程
• 1.2 光系统Ⅱ的结构
• 1.2.1 光系统Ⅱ反应中心
• 1.2.2 放氧复合物
• 1.2.3 捕光天线系统
• 1.3 光系统Ⅱ的生物发生
• 1.4 光系统Ⅱ的动态损伤修复
• 1.4.1 光系统Ⅱ的光抑制损伤
• 1.4.2 光系统Ⅱ的损伤修复循环
• 1.4.3 参与D1周转的蛋白酶系
• 1.5 D1末端加工和D1末端加工酶CtpA
• 1.5.1 加工底物——pD1
• 1.5.2 D1蛋白C末端加工酶（CtpA）
• 1.5.3 D1蛋白C末端加工的生理意义
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料培养
• 2.2 生长曲线测定
• 2.3 叶绿素荧光测定
• 2.4 光合放氧速率测定
• 2.5 突变体的筛选鉴定
• 2.6 核酸操作
• 2.7 RT-PCR分析
• 2.8 类囊体膜制备
• 2.9 色素含量测定
• 2.10 蛋白质定量
• 2.11 聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.12 Western blotting
• 2.13 蓝绿温和胶电泳（BN-PAGE）和第二向SDS-PAGE
• 2.14 AtCTPA1特异抗体的制备
• 2.15 蛋白质免疫定位分析
• 2.16 AtCTPA1基因的互补
• 2.17 AtCTPA1的时空表达和胁迫响应分析
• 2.18 强光胁迫
• 2.19 光抑制处理
• 2.20 光恢复
• 2.21 生物信息学分析
• 3 结果
• 3.1 突变体的筛选鉴定
• 3.2 T-DNA插入对突变体中AtCTPA1表达的影响
• 3.3 atctpa1突变体的基因互补
• 3.4 atctpa1突变体的一般生理表型
• 3.4.1 atctpa1突变体的生长速率
• 3.4.2 atctpa1突变体的色素含量
• 3.4.3 atctpa1突变体的叶绿素荧光分析
• 3.4.4 atctpa1突变体的光合放氧活性
• 3.5 AtCTPA1基因编码蛋白的功能定位分析
• 3.5.1 His-tag融合重组AtCTPA1的原核表达
• 3.5.2 AtCTPA1编码～47kDa的类囊体腔蛋白
• 3.5.3 AtCTPA1蛋白与类囊体膜拓扑结合状态的分析
• 3.6 AtCTPA1蛋白的表达模式
• 3.6.1 AtCTPA1蛋白的时空表达
• 3.6.2 不同环境胁迫因子对AtCTPA1蛋白含量的影响
• 3.7 atctpa1突变体中类囊体膜光合蛋白组分的稳态分析
• 3.8 atctpa1突变体类囊体膜蛋白质复合物的分析
• 3.9 强光胁迫下atctpa1突变体的生长受到抑制
• 3.10 野生型和atctpa1突变体在光抑制条件下光系统Ⅱ活性的变化
• 3.11 光系统Ⅱ活性在弱光下的恢复
• 3.12 强光下光系统Ⅱ反应中心蛋白D1的周转
• 3.13 不同生物中CtpA的同源性分析
• 4.讨论
• 4.1 AtCTPA1编码蛋白的亚细胞定位
• 4.2 AtCTPA1缺失不影响拟南芥在正常光强下的生长
• 4.3 AtCTPA1参与强光下PSII的修复
• 5.结论及展望
• 参考文献
• 致谢