论文摘要
利用乙基甲磺酸（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变的水稻突变体库,筛选到三个水稻侧根与主根伸长受阻的突变体Osslr1-1,Osslr1-2和Osslr1-3（Short lateral root 1）。其突变表型主要表现为其根系的伸长受到严重的抑制,形成短根系突变体。Osslr1突变体的茎的负向地性也受到影响。遗传分析表明突变体是由EMS诱变引起的隐性单基因突变造成的。经过对这个突变体的研究,我们得到以下实验结果:1.Osslr1突变体的主要突变表型是整个根系包括主根、不定根和侧根的生长都受到了严重抑制,造成短根系突变体。同时Osslr1突变体地上部分的负向地性减弱。2.遗传分析表明Osslr1由EMS诱变引起的隐性单基因突变造成的。通过图位克隆,OsSLR1基因定位到1号染色体上的BAC P0506A10。测序分析表明,一个功能未知的基因（LOCOs01g67290）发生了点突变,氨基酸序列由谷氨酰胺（CAA）突变为终止密码子（TAA）。OsSLR1全长5767bp,CDS全长2943bp,编码980个氨基酸,为一个功能未知蛋白。功能恢复实验证明OsSLR1蛋白功能的丧失造成Osslr1的突变表型。测序分析表明,另外两个短侧根突变体为Osslr1的等位突变体,突变位点分别位于基因组序列720bp和3324bp处。4.RT-PCR以及Promoter与GUS报告基因的融合基因转基因结果表明,OsSLR1在植物的根、茎、叶和花中呈组成性表达。生物信息学预测OsSLR1蛋白定位于线粒体内。利用洋葱表皮瞬时表达系统,证明OsSLR1蛋白确实定位于线粒体。5.OsSLR1突变造成突变体对二价金属离子锰、铁、锌、镁和钙的吸收受到抑制,尤其是锰的吸收,突变体地上部分锰含量只有野生型的大约十分之一。同时突变体的主根生长表现对锰毒害超敏,而地上部分由于锰含量的降低表现为抗锰毒害。这些都说明OsSLR1基因对水稻锰的吸收起着至关重要的作用。铁的吸收下降了大约60%,铁吸收和转运相关基因的RT-PCR结果也显示在突变体中这些基因的表达上调,预示着出现缺铁症状。此外突变体还表现在对缺钙和低氮溶液的超敏,在缺钙离子溶液中突变体的根系生长受到严重的抑制,而在低氮的溶液中突变体的根系长度几乎恢复到野生型的表型。综上所述,OsSLR1对水稻正常的根系发育有着重要的作用,对这个基因的深入研究为能使我们更好的理解水稻根系的发生发育机制以及对二价金属离子的吸收转运机制。
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致谢摘要Abstract1.文献综述1.1 植物根系发生发育的研究进展引言1.1.1 植物根系的形态结构1.1.2 主根（胚生根）的发育过程1.1.3 胚后根形态结构和发生发育方式1.1.3.1 侧根的形态结构和发生发育方式1.1.3.2 不定根的形态结构发生发育过程1.2 根系伸长调控机制1.2.1 植物激素1.2.2 细胞周期1.2.3 根分生组织1.2.4 营养元素对根长生长发育的影响1.3 植物对铁和锰吸收研究进展1.4 本研究的目的和意义2.突变体的筛选及表型分析2.1 材料与方法2.1.1 供试材料2.1.2 实验方法2.1.2.1 突变体筛选2.1.2.2 水稻生长条件2.1.2.3 表型分析2.1.2.3.1 表型观察2.1.2.3.2 植株生长与根部参数分析2.1.2.3.3 细胞调亡（埃文斯蓝Evans Blue法和3,3-二氨基联苯胺（DAB））2.1.1.3.4 活性氧测定（NBT（氯化硝基四氮唑蓝）和DAB（3,3-二氨基联苯胺）染色法）2.1.2.3.5 地上部分茎的负向重力性反应分析2.1.2.3.6 水稻营养液的配制2.1.2.3.7 根部细胞的组织形态学观察2.2 结果与分析2.2.1 突变体的筛选和突变体的表型分析2.2.2 根部的组织切片分析2.2.3 细胞调亡（埃文斯蓝Evans Blue法）2.2.3 茎负向地性分析2.2.4 Osslr1对缺钙超敏2.2.5 Osslr1根系伸长受氮饥饿的强烈诱导2.3 小结3.基因克隆及基因表达分析3.1 材料与方法3.1.1 供试材料3.1.2 试验方法2群体的构建及遗传分析'>3.1.2.1 F2群体的构建及遗传分析2群体DNA的提取'>3.1.2.2 突变基因的遗传分析和F2群体DNA的提取3.1.2.3 突变基因的图位克隆3.1.2.4 精细定位的分子标记3.1.2.5 RNA提取及RT-PCR3.1.2.5.1 RNA提取3.1.2.5.2 RNA逆转录3.1.2.5.3 RT-PCR3.1.2.6 基因克隆与测序分析3.1.2.7 回复载体构建3.1.2.8 启动子融合GUS载体构建3.1.2.9 GUS染色及显微观察3.1.2.10 Southern杂交对转基因回复株系的分子验证3.2 结果与分析3.2.1 基因定位群体的创建和遗传分析3.2.2 SLR1基因定位和克隆3.2.2.1 突变基因的定位3.2.2.2 候选基因的分析3.2.2.4 SLR1基因表达模式3.3 小结4 SLR1蛋白的生物信息学分析及其蛋白的亚细胞定位4.1 材料与方法4.1.1 材料4.1.2 方法4.1.2.1 基因家族的进化分析4.1.2.2 基因亚细胞定位分析4.1.2.2.1 基因与GFP融合载体的构建4.1.2.2.2 基因枪法转化洋葱表皮细胞4.1.2.2.2.1 轰击前受体材料的预处理4.1.2.2.2.2 微弹的准备4.1.2.2.2.3 DNA的包裹4.1.2.2.2.4 PDS-1000/He型基因枪的操作4.1.2.2.2.5 轰击后样品的处理4.1.2.2.2.6 GFP荧光的观察4.2 结果4.2.1 SLR1基因的生物信息学分析4.2.2 进化树分析4.2.3 OsSLR1蛋白的亚细胞定位4.3 小结5.突变体对锰和铁的吸收受到抑制5.1 供试材料5.2 实验方法5.2.1 叶绿素含量的测定5.2.2 ICP-MS测定Osslr1和野生型中金属元素的含量5.2.3 半定量、定量RT-PCR分析Fe和Mn吸收、转运相关的基因表达5.3 结果与分析5.3.1 Osslr1对Fe（Ⅲ）的吸收受到抑制5.3.2 slr1突变体的主根对锰毒害超敏而地上部分能抗锰毒害5.3.3 slr1突变体锰和铁等二价金属离子含量下降5.3.4 Osslr1和野生型在不同供Fe状态下,地上部分和根中锰、铁及其他金属离子含量的比较5.3.5 野生型植株在不同Fe供应条件下,Fe和Mn吸收相关基因的表达5.3.5 电子传梯链支路基因和线粒体基因MnSODs的表达5.4 结论结论与展望参考文献附录
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