杨树抗病防御相关基因克隆及功能分析

论文摘要

本研究使用杨树基因组数据库JGI P．trichocarpa v1.0（http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/Poptr1.home.html）对38个差显序列进行了重新注释。注释结果显示11个差显序列为功能未知或和抗病防御相关；进而使用实时定量RT-PCR进行验证工作，实验结果显示在抗病植株Ⅰ-69（Populus deltoides cv.’Lux’ （Ⅰ-69／55））中两个差显序列69-Ⅲ-4和69-Ⅱ-6受病原菌（Marssonina brunnea f. sp. multigermtubi）诱导剧烈上调，69-Ⅲ-4为脂肪氧化酶基因，其在病原侵染后的晚期被诱导表达上调；69-Ⅱ-6为DNA损伤修复蛋白基因，其在病原诱导早期诱导上调。在本研究中，作者从RNA的提取，内对照基因的选择和扩增效率3个方面对实时定量RT-PCR技术进行了优化，建立了一套简便可靠的实时定量RT-PCR的方法，并使用方差分析给与验证。本研究在美洲黑杨Ⅰ-69中克隆得到两个脂肪氧化酶基因PdLOX1和PdLOX2（GenBank accession no．DQ131178，DQ131179）。原核表达分析PdLOX1和PdLOX2，外源蛋白与预测分子量吻合并具有脂肪氧化酶活性。推导氨基酸序列与已知的脂肪氧化酶进行系统发生分析发现PdLOX1和PdLOX2属于脂肪氧化酶类型Ⅱ 13-LOX类群，该类群脂肪氧化酶同多种生物和生物胁迫相关。使用实时定量RT-PCR对PdLOX1和PdLOX2受杨树真菌病原，机械损伤，茉莉酸甲酯，水杨酸处理时的表达情况进行分析表明：PdLOX1和PdLOX2均受M．f．sp．Multkiermtubi诱导上调，PdLOX1受诱导能力较强；两个基因均受茉莉酸甲酯和机械损伤诱导上调；在水杨酸处理时PdLOX1和PdLOX2表达水平下降，通过正向高效液相色谱分析表明两个脂肪氧化酶的酶产物主要为13-HPOD，表现为13-LOX活性，可能参与了茉莉酸的体内合成。通过以上结果我们推测这两个脂肪氧化酶可能在杨树抵抗生物和非生物胁迫中具有重要的作用。本研究中利用杨树基因组初步注释结果和美洲黑杨受真菌病原Marssonina诱后的特异表达的差显片段69-Ⅱ-6序列，克隆了一个DRT100同源基因。原核表达分析发现其具有互补宿主菌recA突变的能力，而且其表达可受真菌病原和水杨酸诱导上调，在茉莉酸甲酯处理下其表达量下降。在本研究中，还同源克隆了一个杨树PGIP基因，其与拟南芥中的PGIP1，2基因高度相似，以上工作为阐述DRT100基因同PGIP基因功能的异同提供了基础。本研究中利用实时定量RT-PCR方法分析杨树抗黑斑病QTLs目标区段候选基因在黑斑病病原诱导下的表达情况，结果显示，一个AP2类型转录因子在抗病植株中表达上调，而在感病植物中其表达量没有明显变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 植物-病原相互作用的分子生物学研究进展
• 1.1 植物宿主特异性抗性中的识别机制
• 1.1.1 无毒蛋白
• 1.1.2 R蛋白
• 1.1.3 抗性蛋白识别无毒蛋白
• 1.2 非宿主病原与植物之间的识别
• 1.3 识别后信号传导
• 1.3.1 R蛋白的激活
• 1.3.2 局部和长距离信号传导
• 1.4 林木—病原相互关系分子生物学研究进展
• 2 实时定量RT-PCR方法
• 2.1 原理与方法
• 2.2 实验过程中几个关键的问题
• 2.2.1 RNA的提取与反转录
• 2.2.2 内对照的标准化
• 第二章 实时定量RT-PCR方法的建立和验证DDRT-PCR
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 病原菌的培养
• 2.2 杨树材料准备及接种实验
• 2.3 总RNA的分离纯化
• 2.4 反转录
• 2.5 实时定量分析
• 2.6 验证管家基因的特异性
• 2.7 从管家基因中选取合适的内对照基因
• 2.8 相对表达量的手工计算
• 3 结果
• 3.1 差显序列的重新注释
• 3.2 实时定量RT-PCR方法的优化
• 3.2.1 RNA的提取与均一化
• 3.2.2 管家基因扩增产物特异性的检测
• 3.2.3 从管家基因中选取稳定表达基因做为内对照基因
• 3.2.4 扩增效率的计算
• 3.2.5 常用浓度下DTT对扩增效率的影响
• 3.3 实时定量RT-PCR分析
• 4 讨论
• 第三章 美洲黑杨两个脂肪氧化酶基因的克隆及表达分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料及病原处理
• 2.2 MeJA,SA和受伤处理
• 2.3 RNA提取及反转录
• 2.4 全长脂肪氧化酶cDNA序列的克隆
• 2.5 实时定量RT-PCR分析
• 2.6 PdLOX1与PdLOX2的原核表达和酶活性分析
• 2.7 酶产物特异性分析
• 2.8 进化树分析
• 3 结果
• 3.1 PdLOX1和PdLOX2全长cDNA克隆及分析
• 3.2 进化树分析
• 3.3 PdLOX1和PdLOX2在受病原,茉莉酸甲酯,水杨酸,受伤诱导下的表达分析
• 3.4 PdLOX1和PdLOX2原核表达分析
• 4 讨论
• 第四章 美洲黑杨DRT100基因和POIP基因克隆和初步功能验证
• 1.引言
• 1.1 DNA损伤修复及UV-B应答研究进展
• 1.2 RecA基因及其在植物中的同源基因
• 2.材料与方法
• 2.1 植物材料及病原处理
• 2.2 MeJA,SA和受伤处理
• 2.3 RNA提取及反转录
• 2.4 全长PdDRT100 cDNA序列的克隆
• 2.5 实时定量RT-PCR分析
• 2.6 PdDRT100原核表达分析
• 2.7 订购拟南芥DRT100突变株及检测
• 2.8 PdDRT100基因过量表达载体构建
• 3.结果与讨论
• 3.1 全长PdDRT100cDNA的克隆及序列分析
• 3.2 实时定量RT-PCR分析
• 3.3 原核表达分析
• 3.4 recA互补实验
• 3.5 拟南芥突变株验证
• 3.6 PdDRT100基因过量表达载体的构建
• 3.7 PdPGIP基因的全长cDNA克隆
• 第五章 美洲黑杨×欧美杨抗黑斑病QTL目标区段的确定及候选基因筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料及病原处理
• 2.2 候选基因筛选及序列分析
• 2.3 实时定量RT-PCR分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 杨树抗黑斑病候选基因
• 3.2 候选基因表达分析
• 参考文献
• 详细摘要