论文题目: 苹果属山定子Mb.nramp1基因克隆及其功能的初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 果树学
作者: 肖海华
导师: 韩振海,印莉萍,许雪峰
关键词: 苹果属山定子,酵母突变株,亚细胞定位
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: Nramp(Natural Resistance-Associated Macrophage Protein)是一个膜整合蛋白家族,该家族基因成员在金属离子的转运,尤其是在铁离子的代谢中起着重要的调控作用。本文以苹果属抗寒砧木山定子(Malus baccata(L.)Borkh)为试材,根据植物中Nramp1基因的保守区域设计简并引物,采用RT-PCR与RACE法相结合,从苹果属山定子中克隆Nramp1基因,并在真核模式生物酵母中对该基因功能进行了初步研究。主要结果如下: 1.率先从苹果属山定子中克隆到一条长为2090 bp的cDNA序列,该基因含有长为1656 bp的开放阅读框,编码531个氨基酸。将所得序列在GenBank中进行同源性比较,结果表明该基因属于Nramp基因家族,而且与番茄中的Nramp1基因具有极高的同源性,将该基因命名为Mb.nramp1,基因登录号为AY724413。与植物中的同源基因进行序列比对,结果表明Mb.NRAMP1与LeNRAMP1具有很高的同源性,同源性为66%,相似性为80%;与OsNRAMP1的同源性为63%,相似性为68%;与AtNRAMP1同源性为55%,相似性58%。Mb.NRAMP1蛋白含有推断的N-端相连的糖基化位点,12个推断的跨膜域(TMs)和在第八和九个跨膜域之间第四个胞内环中有一个一致的转运基序。 2.山定子中该基因为单拷贝。正常供铁条件下,Mb.nramp1基因在根中转录水平极低,在叶片中几乎不表达。缺铁条件下,Mb.nramp1基因在根中转录水平迅速提高,直到缺铁15天时转录仍处于较高水平。然而,直到缺铁15时时叶片中表达仍然很微弱。 3.Mb.nramp1基因转化酵母突变株DEY1453生长状况明显好于空载体转化后的突变株。培养基中BPDS增加到15 μM时,转化了Mb.nrampl的酵母细胞生长状况与野生型相差无几。在30μM BPDS时,Mb.nrampl转化的细胞与低浓度BPDS相比生长延缓,但是明显优于空载体转化的DEY1453突变株。与较低浓度BPDS相比,野生型酵母(DY1457)的生长量也减少了。初步证明Mb.nramp1编码具有功能的铁转运蛋白,转运蛋白Mb.NRAMP1能够使酵母吸收铁的突变株恢复突变。进一步在酵母细胞中对Mb.NRAMP1进行亚细胞定位研究,结果表明该蛋白主要位于细胞膜内侧的内吞泡膜上,还有一小部分位于多聚小泡上。 初步提出植物中存在第三种铁吸收机制-内吞机制,构建了内吞机制模型。
论文目录:
第一章 文献综述
1．1 机理Ⅰ植物的分子生物学机理研究
1．2 机理Ⅱ植物的分子生物学机理研究
1．3 编码参与烟酰胺和铁载体生成的酶的基因
1．4 调控基因
1．5 其他基因
1．6 参与铁吸收的调节机制
1．7 植物中可能存在的机理Ⅲ
1．8 意义及目的
第二章 Mb.nramp1基因克隆及序列分析
2．1 试验材料
2．1．1 植物材料
2．1．2 菌株，载体与试剂
2．2 试验方法
2．2．1 总RNA的提取
2．2．2 第一链cDNA的制备
2．2．3 引物设计与目的片段扩增
2．2．4 目的片断克隆
2．2．5 Mb nramp1基因全长序列分析
2．3 结果与分析
2．3．1 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
2．3．2 Mb nrampl基因cDNA特异片段的扩增、克隆与测序
2．3．3 3′-RACE与5′-RACE及其产物克隆、酶切鉴定和序列分析
2．4．4 全长序列的拼读，克隆与测序
2．4．5 序列比对与进化树分析
第三章 Mb.nramp1在山定子中的杂交分析
3．1 植物材料
3．2 所用试剂
3．3 试验方法
3．3．1 Southern杂交
3．3．2 Northern杂交
3．4 试验结果
3．5．1 Southern杂交
3．5．2 Mb.nramp1的时空表达分析
第四章 异源互补法鉴定Mb.nramp1基因的功能
4．1 试验材料
4．1．1 菌株，质粒
4．1．2 引物设计
4．1．3 酵母生长培养基
4．1．4 酵母转化试剂盒
4．2 试验方法
4．2．1 酵母表达载体地构建
4．2．2 酵母转化
4．3 结果与分析
4．3．1 重组质粒的酶切鉴定
4．3．2 异源互补法验证Mb.nramp1的功能
第五章 Mb.nramp1在酵母中的亚细胞定位
5．1 试验材料
5．1．1 菌株、质粒
5．1．2 培养基
5．1．3 引物设计
5．1．4 酶与试剂盒
5．2 试验方法
5．2．1 载体构建
5．2．2 酵母转化与显微镜观察
5．3 结果与分析
5．3．1 酵母表达载体的构建
5．3．2 亚细胞定位
第六章 讨论
6．1 苹果中Nramp1基因克隆策略
6．2 Mb.nramp1参与了苹果体内对缺铁胁迫信号的应答机制
6．3 异源互补法研究Mb.nramp1基因的功能
6．4 利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对Mb.Nramp1基因亚细胞定位
6．5 植物吸收铁机理Ⅲ-吞噬机理模型的初步设想
第七章 结论
参考文献
致谢
个人简历
附录
1 Mb.nramp1基因全长测序结果
2 EGFP基因ORF测序结果
3 Mb.nramp1 ORF酶切位点分析
4．EGFP ORF酶切位点分析
5．酵母表达载体pGBKT7
6．植物表达载体pBI121
发布时间: 2005-07-22
参考文献
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