磺胺类兽药残留化学发光免疫检测方法的研究

论文摘要

本论文对磺胺类兽药残留的化学发光免疫检测方法进行了深入系统的研究。通过免疫兔子获得抗磺胺类药物多克隆抗体。全面优化了检测方法中的各个参数,包括抗体包被量、酶标抗原的浓度、酶标抗原稀释液的种类及发光底物的浓度,建立了磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测方法,并对方法的性能指标进行了系统评价。该化学发光免疫检测方法的特异性通过十六种磺胺类药物的竞争反应进行了测定。与传统的显色酶联免疫吸附测定方法相比,灵敏度普遍有所提高,有的要提高2～3倍。十六种磺胺的最低检测限范围在0.1～31.0μg/L。选取了鸡肉和猪肉作为主要检测样品,通过磷酸盐缓冲液简单稀释即可消除样品的基质影响。实验选取了磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺吡啶五种磺胺药物进行了添加回收实验。结果表明用磷酸盐缓冲液作为提取溶剂的平均回收率为62.1～110.3%,且变异系数普遍在15%以下。通过高效液相色谱检测方法对已建立的化学发光免疫检测方法进行了确证。并将两种方法的检测结果进行线性回归分析,其中鸡肉和猪肉样品的相关系数R~2分别为0.9546和0.9379,说明该检测方法的准确性较好。本实验还对猪肉样品添加回收测定结果与显色酶联免疫吸附测定的结果进行了比较,相关系数为0.9481,表明两种免疫检测方法一致性较好。论文还对发光底物的进行了探索,研究出了底物新配方。虽然其稳定性仅为7天左右,但可为进一步研究发光底物提供参考。该化学发光免疫检测方法可以满足美国和欧盟对磺胺类药物最高残留限量100μg/L的检测标准,并为进一步研究其他农兽药的化学发光免疫检测奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 兽药残留概述
• 1.1.1 兽药残留
• 1.1.2 兽药残留的危害
• 1.1.3 控制动物源性食品中兽药残留措施
• 1.2 磺胺类药物概述
• 1.2.1 磺胺类药物简介
• 1.2.2 磺胺类药物的抗菌作用机制
• 1.2.3 磺胺类药物在兽医临床上的应用
• 1.2.4 磺胺类药物的毒性作用
• 1.2.5 磺胺类药物对食品的污染及残留限量
• 1.2.6 磺胺类药物的常用分析方法简介
• 1.3 化学发光免疫检测技术
• 1.3.1 化学发光基本原理
• 1.3.2 化学发光酶免疫测定
• 1.4 论文研究的目的及意义
• 1.5 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗体的制备
• 2.2.2 抗体的纯化
• 2.2.3 抗体浓度的测定
• 2.2.4 直接竞争酶联免疫测定（ELISA）方法操作步骤
• 2.2.5 增强化学发光酶免疫分析（ECL-ELISA）检测方法的建立
• 2.2.6 方法特异性的测定
• 2.2.7 实际样品的处理方法
• 2.2.8 ECL-ELISA检测方法性能指标的评价
• 2.2.9 ECL-ELISA方法的确证实验
• 2.2.10 发光底物的探索
• 3 结果与讨论
• 3.1 抗磺胺类药物抗体和酶标抗原的制备
• 3.2 抗磺胺类药物抗体的纯化
• 3.3 增强化学发光酶免疫分析（ECL-ELISA）各参数的优化
• 3.3.1 包被抗体浓度的优化
• 3.3.2 酶标抗原稀释倍数的确定
• 3.3.3 酶标抗原稀释液的确定
• 3.3.4 发光底物的优化
• 3.4 方法特异性
• 3.5 样品基质影响的消除
• 3.6 磺胺类药物ECL-ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.6.1 五种磺胺药物检测限及灵敏度
• 3.6.2 ECL-ELISA检测方法的准确度
• 3.6.3 精密度
• 3.7 高效液相色谱方法确证
• 3.7.1 猪肉和鸡肉样品处理方法
• 3.7.2 HPLC与ECL-ELISA法检测结果的相关性
• 3.8 ECL-ELISA与显色ELISA回收率测定结果的比较
• 3.9 发光底物的探索
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 研究生期间发表论文情况
• 8 致谢