一个光合组织特异表达启动子的克隆、功能分析及其转录因子的鉴定

论文题目: 一个光合组织特异表达启动子的克隆、功能分析及其转录因子的鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 杨予涛

导师: 郑成超

关键词: 组织特异表达,缺失分析,转基因烟草,酵母单杂交,转录因子

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 组成型启动子如CaMV(花椰菜花叶病毒)35S 启动子和Ubiquitin(泛素)启动子,在转基因植物的研究中得到了广泛运用。由于组成型启动子不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达,在作物的遗传改良中存在一定的缺陷。组织特异启动子作为一类专一性启动子,能指导外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达,它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累,增加区域表达量,而且也避免了植物营养的浪费。因此,寻找专一性启动子,使外源基因特异、高效的表达已成为植物基因工程的关键环节。PNZIP 是我们从短日照植物裂叶牵牛中分离出来的一个基因,它编码一种含有碱性亮氨酸拉链的蛋白质,原位杂交发现该基因在叶肉中高效表达,而在非光合组织中不表达。因此,为了分离具有自主产权的叶片特异启动子,我们用接头PCR 的方法克隆了长度为1415bp 的PNZIP 启动子并将其与GUS 基因融合,然后对PNZIP 启动子进行了组织表达分析、5′端缺失分析、3′端缺失分析,同时利用酵母单杂交的技术分离了一个可以和该启动子结合的转录因子,并对该转录因子进行了表达分析以及体内、体外功能分析,主要结果如下: 1. 根据PNZIP 基因编码区的上游序列,设计专一引物,利用接头PCR 的方法,从裂叶牵牛中克隆了长度为1415bp 的PNZIP 启动子,基因银行的注册号为AF373414。引物延伸实验证明PNZIP 基因的转录起始位点位于翻译起始位点上游122bp 处,对应启动子序列5′-ACAGTACACTCTAC-3′中的第4 个A,转录起始位点在PNZIP 启动子TATA-box 下游30bp 处,不仅符合真核生物转录起始位点的位置特征,同时也符合Breathnach 提出的真核生物基因转录起始位点邻近序列的一般规律。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

英文缩略表

1. 引言

1.1 植物启动子的基本结构

1.1.1 转录起始位点的特点

1.1.2 TATA-box

1.1.3 CAAT-box

1.1.4 GC-box

1.1.5 特殊的上游顺式作用元件

1.2 组成型启动子

1.2.1 CaMV35S启动子

1.2.2 CsVMV 启动子

1.2.3 Act1启动子

1.2.4 Ubiquitin 启动子

1.2.5 NOS、OCS 启动子

1.3 诱导型启动子

1.3.1 光诱导启动子

1.3.2 伤诱导启动子

1.3.3 植物激素诱导启动子

1.3.3.1 生长素诱导启动子

1.3.3.2 赤霉素诱导启动子

1.3.3.3 脱落酸诱导启动子

1.3.3.4 乙烯诱导启动子

1.3.3.5 水杨酸诱导启动子

1.3.3.6 茉莉酮酸诱导启动子

1.3.4 温度诱导启动子

1.3.4.1 高温诱导启动子

1.3.4.2 低温诱导启动子

1.4 组织特异性启动子

1.4.1 根特异启动子

1.4.2 韧皮部特异表达启动子

1.4.2.1 植物病毒来源的韧皮部特异表达启动子

1.4.2.2 植物来源的韧皮部特异表达启动子

1.4.2.3 植物病原菌来源的韧皮部特异表达启动子

1.4.3 维管束特异表达启动子

1.4.4 叶片表达启动子

1.4.4.1 光诱导型叶片特异表达启动子

1.4.4.2 组成型叶片特异表达启动子

1.4.5 花特异表达启动子

1.4.5.1 花药特异表达启动子

1.4.5.2 花粉特异表达启动子

1.4.6 果实特异表达启动子

1.4.7 种子特异表达启动子

1.4.7.1 单子叶植物种子特异表达启动子

1.4.7.2 双子叶植物种子特异表达启动子

1.5 植物碱性亮氨酸拉链蛋白的结构和分类

1.5.1 植物bZIP 蛋白的结构

1.5.2 植物bZIP 蛋白的分类

1.5.3 植物bZIP 蛋白的功能

1.6 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 酶与各种生化试剂

2.1.4 实验用的引物和寡核苷酸

2.2 实验方法

2.2.1 植物基因组总 DNA

2.2.2 植物基因组 DNA 的纯化

2.2.3 植物总 RNA 的提取

2.2.3.1 异硫酸氰胍-酸性酚-LiCl 法

2.2.3.2 用 RNeasy Plant Mini Kit 提取总 RNA

2.2.3.3 RNA 纯化

2.2.4 PNZIP 启动子的分离

2.2.5 DNA 片段与克隆载体的连接

2.2.6 大肠杆菌 DH5α感受态的制备

2.2.7 大肠杆菌细胞的转化

2.2.8 克隆载体的酶切鉴定

2.2.9 序列的测定

2.2.10 质粒 DNA 的提取

2.2.10.1 煮沸法

2.2.10.2 大量法提质粒

2.2.11 PNZIP 基因转录起始位点的鉴定

2.2.12 亚克隆的测序

2.2.13 凝胶电泳中 DNA 片段的回收

2.2.14 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备

2.2.15 冻融法转化农杆菌

2.2.16 农杆菌介导的烟草的转化

2.2.17 GUS 活性的组织化学分析

2.2.18 GUS 基因表达的定量分析

2.2.19 Northern 杂交

2.2.19.1 RNA 提取及电泳

2.2.19.2 转膜及烘膜

2.2.19.3 探针的合成

2.2.19.4 预杂交及杂交

2.2.20 Southern 杂交

2.2.20.1 限制性内切酶消化

2.2.20.2 转膜

2.2.20.3 预杂交及杂交

2.2.21 植物核蛋白的提取

2.2.22 EMSA 探针的标记

2.2.23 EMSA 探针的纯化

2.2.24 制备聚丙烯酰胺凝胶

2.2.25 DNA 探针与蛋白质的结合

2.2.26 电泳、干胶及放射自显影

2.2.27 小量 LiAc/PEG 法制备酵母感受态细胞及其质粒转化

2.2.28 报告载体的3-AT 浓度的选择

2.2.29 酵母质粒提取

2.2.30 烟草mRNA 的分离

2.2.31 烟草 cDNA 第一链的合成

2.2.32 文库蛋白双链 DNA 的合成

2.2.33 双链文库 DNA 的纯化

2.2.34 报告载体和cDNA 文库质粒向酵母的共转化

2.2.35 阳性克隆的互作分析

2.2.36 文库插入片段的分离和电泳鉴定

2.2.37 阳性克隆全长序列的获得

2.2.37.1 烟草cDNA 第一条链的合成

2.2.37.2 阳性克隆 5′ 端序列的获得

2.2.37.3 cDNA 全长序列的获得

2.2.38 原核表达烟草 NtbZIP 蛋白

2.2.38.1 原核表达载体的构建

2.2.38.2 大肠杆菌 BL21 原核表达的诱导

2.2.38.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.2.38.4 目的蛋白的纯化

2.2.39 启动子活性的瞬时表达分析

2.2.39.1 烟草叶片的处理

2.2.39.2 轰击时微弹的准备

2.2.39.3 基因枪的轰击

2.2.40 农杆菌介导的目的蛋白的细胞定位

2.2.40.1 洋葱表皮细胞的浸染和转化

2.2.40.2 目的蛋白的细胞定位观察

3 结果与分析

3.1 PNZIP 启动子是一个光合组织特异表达强启动子

3.1.1 PNZIP 启动子的分离

3.1.2 PNZIP 启动子转录起始位点的确定

3.1.3 PNZIP 全长启动子与 GUS 基因融合

3.1.4 番茄 Rbcs-3A 启动子与 GUS 基因融合

3.1.5 含有 PNZIP 全长启动子、Rbcs-3A 启动子转基因烟草的获得

3.1.6 GUS 活性与转基因拷贝数的关系

3.1.7 PNZIP 启动子是一个光合组织特异表达启动子

3.2 PNZIP 启动子是一个受昼夜节律调控的启动子

3.3 PNZIP 启动子的调控分析

3.3.1 PNZIP 启动子的结构分析

3.3.2 PNZIP 启动子不同缺失突变体的获得

3.3.2.1 PNZIP 启动子 5′ 端缺失突变体的获得

3.3.2.2 PNZIP 启动子 3′ 端缺失突变体的获得

3.3.2.3 PNZIP 启动子 3′ 端缺失片段与 90-35S 启动子的嵌合

3.3.3 含有不同长度 PNZIP 启动子转基因烟草的获得

3.3.4 各类转基因烟草 GUS 活性的检测

3.3.4.1 PNZIP 启动子的外部缺失突变体驱动 GUS 基因表达活性的检测

3.3.4.2 PNZIP 启动子的内部缺失突变体驱动 GUS 基因表达活性的检测

3.3.4.3 PNZIP 启动子的内部缺失片段与 90-35S 启动子嵌合体的 GUS 活性的检测

3.3.5 GAAATA 元件是一个正调控元件

3.3.5.1 GAAATA 元件可以和烟草核蛋白特异性结合

3.3.5.2 GAAATA 元件中参与和烟草核蛋白结合的关键核苷酸

3.3.5.3 GAAATA 元件是一个正调控元件

3.3.6 GATACT 元件、G-box 元件相互作用决定了启动子的叶片特异表达

3.3.7 ODN 技术对 PNZIP 启动子-379 到-100 区段的功能鉴定

3.4 与 PNZIP 启动子-379 到-100 区段结合转录因子的克隆与功能分析

3.4.1 与 PNZIP 启动子-379 到-100 区段结合转录因子的克隆

3.4.1.1 酵母报告载体的构建

3.4.1.2 酵母报告载体向酵母 Y187 的转化以及3-AT 浓度的选择

3.4.1.3 烟草cDNA 文库的构建

3.4.1.4 报告载体和cDNA 文库质粒向酵母的转化

3.4.1.5 阳性克隆的初步筛选

3.4.1.6 部分阳性克隆文库载体与报告载体作用强弱的鉴定

3.4.1.7 部分阳性克隆的复筛

3.4.1.8 阳性克隆的测序和分析

3.4.1.9 NtbZIP 全长序列的获得

3.4.2 NtbZIP 基因序列的分析

3.4.3 NtbZIP 蛋白 DNA 结合特性的分析

3.4.3.1 NtbZIP 基因的原核表达

3.4.3.2 NtbZIP 蛋白的纯化

3.4.3.3 NtbZIP 重组蛋白与 PNZIP 启动子-379 到-100 区段结合

3.4.4 NtbZIP 蛋白可以增强 PNZIP 启动子-379 到-100 区段的活性

3.4.5 NtbZIP 基因的亚细胞定位

3.4.6 NtbZIP 基因的 Southern 杂交分析

3.4.7 NtbZIP 基因的表达分析

4 讨论

4.1 PNZIP 启动子是一个特殊的组织特异启动子

4.1.1 PNZIP 启动子是一个光合组织特异启动子

4.1.2 PNZIP 启动子受昼夜节律调控

4.2 PNZIP 启动子可能的调控方式

4.2.1 G-box 与 GATACT 相互作用共同决定启动子的叶片特异表达

4.2.2 GAAATA 元件是一个正调控元件

4.2.3 Box-II 是一个正调控元件

4.2.4 A/T 富集基序是一个正调控元件

4.3 酵母单杂交试验中的假阳性和假阴性

4.4 NtbZIP 基因编码一种含有亮氨酸拉链的蛋白质

4.5 融合蛋白的原核表达和培养条件对表达产量的提高

5. 结论

参考文献

附录1

附录2

致谢

发布时间: 2005-10-11

参考文献

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