论文摘要
小麦（Triticum aestivum L.）条锈病是由条形柄锈菌（Puccinia sriiformis f. sp. tritici）引起的一种高空远距离传播的毁灭性真菌病害。研究证明,选育并合理利用抗病品种是防治小麦条锈病最安全、经济、有效的方法。南京农业大学细胞遗传所选育的普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系（“92R?”系列）不仅对白粉病表现广谱抗性,而且在云南、四川、陕西等条锈病高发区多年种植,对条锈病也表现广谱抗性,高抗目前我国大多数强毒性流行小种。国际小麦基因命名委员会已将该品系所含条锈病抗性基因正式命名为Yr26,含此抗条锈病基因的品系是我国当前广泛使用的有效抗源之一。因此,开展Yr26与条锈病互作机理及重要抗条锈病相关基因的克隆,对于条锈病抗病育种具有重要意义。鉴于小麦基因组的庞大和复杂性,以及本实验室前期的研究又将Yr26定位于1B染色体近着丝粒区域,试图通过图位克隆方法克隆Yr26十分困难。因此,本研究主要利用小麦基因芯片技术从转录组水平上了解小麦与条锈菌互作的基因表达特征、结合染色体电子定位及比较基因组学方法筛选和克隆抗条锈病相关基因,进一步利用病毒诱导的基因沉默和转基因技术鉴定其参与条锈病抗性的初步功能,为阐释小麦抗条锈病的分子机理以及开展抗条锈病小麦基因工程育种提供实验依据。本论文主要研究内容及结果如下：1.小麦抗条锈病基因Yr26相关基因的筛选利用基因芯片技术,获得了含抗条锈病基因Yr26小麦Y263（扬麦158的近等基因系）条锈菌诱导0小时,92R137、Y263、感病小麦扬麦158条锈菌诱导12和36小时的基因表达谱。分别比较分析了条锈菌诱导12和36小时两个时间段抗病材料Y263和92R137相对于感病材料扬麦158的共同差异表达基因。结果表明：条锈菌诱导12h,Y263和92R137相对于扬麦158共同上调表达基因278个,共同下调表达基因313个。利用Blast2go对上述差异表达基因分别进行GO （gene ontology）分析,发现共同上调表达基因中,128个具有GO信息；共同下调表达基因中,130个具有GO信息。GO分类发现与外膜成分、次级代谢、分子功能调节、四吡咯结合、电子转运和酶结合活性等相关的功能基因仅在共同下调表达探针中发现。染色体电子定位结合与二穗短柄草比较基因组学分析表明：共同上调表达的基因中,22个定位于小麦第一部分同源群,23个定位于短柄草与Yr26同源区段,3个既定位于小麦第一部分同源群又位于短柄草与Yr26同源区段；共同下调表达的基因中,29个定位于小麦第一部分同源群；41个定位于短柄草与Yr26同源区段,7个既定位于小麦第一部分同源群又定位于短柄草与Yr26同源区段。条锈菌诱导36h,Y263和92R137相对于扬麦158共同上调表达基因299个,共同下调表达基因658个。利用Blast2go对上述差异表达基因分别进行GO分析,发现共同上调表达基因中,135个具有GO信息；共同下调表达基因中,305个具有GO信息。GO分类发现与核酸-蛋白复合物、外膜组分、有机物代谢过程、色素代谢过程、核糖体结构组成、连接酶活性和信号转导活性等相关的功能基因仅在共同下调表达探针中发现。染色体电子定位结合与二穗短柄草比较基因组学分析表明：共同上调表达的基因中,20个定位于小麦第一部分同源群,32个定位于短柄草与Yr26同源区段,2个既定位于小麦第一部分同源群又位于短柄草与Yr26同源区段；共同下调表达的基因中,68个定位于小麦第一部分同源群,100个定位于短柄草与Yr26同源区段,25个既定位于小麦第一部分同源群又定位于短柄草与Yr26同源区段。利用Blast2go分别对条锈菌诱导12h和36h,Y263和92R137相对于扬麦158共同上调表达基因中定位于小麦第一部分同源群或短柄草与Yr26同源区段的基因进行功能注释,以筛选到参与Yr26抗病反应的候选或相关基因。2.Yr26相关基因的克隆与特征分析根据基因芯片的分析结果,选择了两个Y263和92R137相对于扬麦158共同上调表达基因中定位于小麦第一部分同源群或短柄草与Yr26同源区段且功能注释与抗病相关的探针进行克隆,并对其结构和表达特征分析。探针Ta.27275.1.S1 at预测为Lr10类抗病基因,利用RACE方法从92R137中获得了其同源基因,该基因cDNA全长3148bp,ORF为2826bp,编码941个氨基酸。经SMART软件预测发现,该基因编码一个NB-ARC结构域,在N端具有18个氨基酸组成的信号肽,在C端包含一个SCOP的结构域。该基因与粗山羊草RPM1同源性最高,因此将该基因暂命名为TaRPMl.利用中国春缺体／四体将TaRPM1定位于小麦1D染色体上,条锈菌诱导后,TaRPM1在抗病材料中上调表达,在感病材料中表达量较低。推测该基因参与了Yr26介导的抗条锈病反应。探针Ta.14847.1.Alat预测为与抗病相关的F-box蛋白,利用电子克隆技术从抗条锈病小麦92R137中克隆出该探针的同源基因,其ORF全长1062bp,无内含子,编码353个氨基酸的F-box蛋白,在其C端具有三个Kelch重复序列,为典型的F-box类蛋白。本研究首次在小麦中克隆此类基因,并将该基因命名为TnFBK。根据对一粒小麦、节节麦、圆锥小γ-80、92R137、扬麦158等基因组中TaFBK的测序结果分析表明,TaFBK在小麦基因组中存在3个同源基因,分别被命名为TaFBK-A、TaFBK-B、和TaFBK-D,通过与二穗短柄草比较基因组学分析将这三个基因分别定位于小麦第一部分同源群的1A、1B、1D上。核苷酸序列分析表明,三个基因间序列差异主要是由单碱基突变导致。通过克隆抗、感材料中受条锈菌诱导后的该基因的cDNA序列并测序分析,结果表明TaFBK-B给Yr26抗病材料中特异受诱导表达的序列类型,而感病材料中则主要表达TaFBK-D。通过对抗病材料外施激素后的基因表达分析表明,TaFBK主要受茉莉酸甲酯MeJA秀导上调表达,推测该基因可能通过MeJA介导的信号途径响应对条锈病的抗性反应。3.候选基因的功能分析利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）和转基因方法,分别从基因沉默水平和过量表达水平对候选基因进行了功能分析。TaRPM1基因的VIGS实验结果表明：TaRPM1被沉默后的92R137表现出一定程度的感病症状,对CYR32的反应型由0-1级转变为4-5级,组织学观察结果与表型鉴定结果一致。转化TaRPM1基因植株T1代中有一个株系叶片出现强烈的过敏反应,对条锈菌抗性明显提高。综合表达分析及功能验证结果,推测TaRPM1可能参与Yr26介导的条锈菌抗性反应。TaFTBK因的VIGS实验结果表明：TaFBT沉默后的92R137表现出一定程度的感病症状,对CYR32的反应型由0-1级转变为4～6级,组织学观察结果与表型鉴定结果一致。转化TaF’K-D基因T1代中有四个株系在成株期抗病性明显提高,TaFBK-B转基因株系抗病性鉴定正在进行中。结合TaFBK-B是含Yr26抗病材料中特异受诱导表达的序列类型,而感病材料中则主要表达TaFBK-D,同时TaFBK响应MeJA的诱导表达,推测TaFBK可能通过MeJA介导的信号途径参与Yr26介导的条锈菌抗性反应,其中TaFBK-B可能起主要的作用。
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