中国金孢霉资源初步调查、分类及产角蛋白酶研究

论文摘要

真菌及其遗传资源和代谢产物资源是人类宝贵的生物资源。随着多学科的协同发展及相互渗透，尤其是分子生物学的迅速发展，人类将从真菌的遗传资源和代谢产物资源中获得越来越多的利益。就当今生物技术市场而言，真菌资源在医药、食品、农业、能源、精细化工、生物农药和环境保护等领域都得到了广泛的应用。金孢霉Chrysosporium corda是一类非常重要的真菌资源，全世界现已报道记载金孢霉约90余种，其应用价值和潜在的应用价值作者已做过较好的评述。作为以上这些研究和应用的基础研究工作，资源调查及分类工作受到了人们极大的重视。在国家自然科学基金（30270011）的支持和导师的指导下，本文作者对中国金孢霉资源进行了系统研究并取得如下研究结果：1、全球金孢霉有效分类单元认定。在系统收集和阅读研究全球金孢霉大量文献基础上，综述了金孢霉属的分类特征和历史进展；通过对全球已发表的92个金孢霉成员的文献进行研究整理，作者初步认定金孢霉属现仅包含51个有效分类单元。2、在系统收集和阅读研究全球已知种文献的基础上，研编了以培养性状和微观特征为主的金孢霉属已知有效分类单元的Access表征检索数据库。实践结果表明，这个数据库对待定菌株的初步鉴定方便、快捷、有效。3、对我国13个省市的金孢霉资源进行了调查和分类研究。从这些地区采集的438份土样中分离到大量真菌菌株，经初步鉴定，共获得36株金孢霉，加上贵州大学真菌资源研究所保存的标本和菌种，作者共观察研究了41株金孢霉。在以表型特征为主的基础上，现已描述鉴定出：[1]新纪录1个热带金孢Chrysosporium tropicum J．W.Carmichael[2]新种3个平武金孢Chrysosporium pingwuense Z．Q．Liang,J．D．liang&Y．F．Han．sp．nov．阿坝金孢Chrysosporium abaense Z．Q．Liang,J．D．liang&Y．F.Han．sp．nov．尧都金孢Chrysosporium yaoduense Z．Q．Liang,J．D．liang&Y．F．Han．sp．nov．[3]相关属——地丝霉属Geomyces的新纪录种1个毡状地丝霉毡状变种Geomyces pannorum（Link）Sigler&Carmichael var．Pannorum4、初步统计显示，金孢霉在我国南北方均有分布，具有一定的地理分布多样性。从统计的资料可以看出，以秦岭——雅河为南北方划分界线，北方金孢霉菌株的检出率（10．3％）比南方（5．9％）要高，这也初步显示出金孢霉属真菌较为耐寒、耐旱，抗逆性和适应能力较强，是在地理上分布较广的一个真菌类群。5、产角蛋白酶优良菌株的初筛及其产酶条件研究参照Wawrzkiewicz的方法，对分离获得的金孢霉部分菌株和其他几个菌株进行了产角蛋白酶的初筛，结合镜检观察，紫外法测定和用RSA法对单因素实验结果进行了优化。获得如下有新意的结果：[1]经筛选得到较高产的GZDXIFR-H-49-2产酶菌株。[2]在所试条件下，补充C源、补充N源、补充S源和无机离子中分别是可溶性淀粉、尿素、硫代硫酸钠和氯化钙时对产酶的促进作用最大。[3]RSA法优化获得的二次多项式模型是：Y1=5266．667-25 X1-162．5 X2-212．5 X3-1058．333 X12-175 X1X2-575X1X3-1783.333X22-1633.333X32分析此模型可知存在最大值点，当X1=0．010154，X2=-0．046059，X3= -0．066838时，即以羽毛粉为20．10g／L、尿素为0．9770 g／L、初始PH为7．933和其他无机离子（NaCl5g/L，K2HPO4 6 g／L，KH2PO4 1 g／L）为发酵培养基，发酵条件在所试范围之时能够得到预期最大酶活为5277．38 U／L。此结果是以基础培养基发酵时所得酶活800U/L的6.6倍。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 金孢霉属Chrysosporium Corda的分类研究进展
• 1.1 金孢霉属的经典分类研究进展
• 1.2 分子生物学在金孢霉属系统学研究和物种鉴定中的应用
• 2 金孢霉属资源的开发利用现状及研究利用潜力
• 2.1 在医药卫生研究开发中的意义及利用前景
• 2.1.1 天然新药物筛选
• 2.1.2 媒介昆虫的生物控制
• 2.1.3 值得重视的兼性病原
• 2.2 在造纸和纺织生物技术中的应用价值
• 2.3 在食品、饲料、日用化工等工业及环保中的利用价值
• 3 角蛋白酶的应用价值及应用前景
• 3.1 饲料工业和肥料工业中的应用及应用价值
• 3.2 在医学领域的研究及展望
• 3.3 在皮革工业中的应用
• 3.4 在洗涤用品、美容产品、食品工业、环境治理及纺织中的应用
• 第二章 中国部分省区金孢霉资源调查及分类研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 分离用土样
• 1.1.2 试验用培养基
• 1.1.3 用具、试剂及设备
• 1.1.3.1 用具
• 1.1.3.2 试剂
• 1.1.3.3 主要设备
• 1.1.4 乳酸石炭酸棉蓝染色液:
• 1.2 方法
• 1.2.1 金孢霉属资源经典分类研究方法
• 1.2.1.1 已知种数据库的建立
• 1.2.1.2 土壤中金孢霉的分离
• 1.2.1.3 菌种的分离、纯化
• 1.2.1.4 菌株分解角蛋白的检测方法
• 1.2.1.5 温度实验
• 1.2.1.6 菌种的描述鉴定
• 1.2.2 分子鉴定方法
• 1.2.2.1 DNA提取试剂的配制
• 1.2.2.2 基因组DNA的提取
• 1.2.2.3 基因组DNA的检测
• 1.2.2.4 DNA纯度的检测
• 1.2.2.5 PCR扩增
• 1.2.2.6 DNA序列数据分析
• 1.2.3 菌种的保存
• 2 结果与分析
• 2.1 全球金孢霉属有效种名总览
• 2.2 金孢霉属Chrysosporium Corda有效分类单元的表征数据库
• 2.3 我国部分地区发现的金孢霉
• 2.4 金孢霉属中国新纪录种的鉴定和描述
• 2.5 分离发现的一些金孢霉属新种的鉴定和描述
• 2.6 其他相关属种的描述
• 2.7 分类地位未定的种
• 第三章 产角蛋白酶优良菌株的筛选及其产酶条件研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要实验仪器及设备
• 1.1.2 实验试剂及培养基
• 1.1.3 实验用菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 鸡毛粉（或头发粉）的制备
• 1.2.2 鸡毛可溶性角蛋白的（KS）的制备
• 1.2.3 KS作为唯一碳氮源平板筛选
• 1.2.4 降解鸡毛粉的显微检查
• 1.2.5 粗酶液的制备
• 1.2.6 角蛋白酶活力的测定
• 1.2.7 液体摇瓶培养的单因素优化
• 1.2.7.1 发酵结束时间的确定
• 1.2.7.2 补充C源
• 1.2.7.3 补充N源
• 1.2.7.4 补充S源
• 1.2.7.5 无机离子
• 1.2.8 菌株H-49-2产酶条件的优化方法
• 2 结果与分析
• 2.1 产酶菌株的筛选结果与分析
• 2.1.1 用含鸡毛粉或头发粉的筛选培养基筛选的结果与分析
• 2.1.2 用含KS的筛选培养基筛选的结果与分析
• 2.2 菌株H-49-2降解鸡毛粉的显微检查
• 2.3 液体摇瓶培养的单因素优化结果与分析
• 2.3.1 发酵结束时间
• 2.3.2 不同补充C源对产酶活力的影响
• 2.3.3 不同补充N源对产酶活力的影响
• 2.3.5 不同无机离子对产酶活力的影响
• 2.4 菌株H-49-2产酶条件的优化实验结果与分析
• 2.4.1 Plackett-Burman设计对产角蛋白酶重要因素的筛选结果
• 2.4.2 RSA法优化实验结果
• 2.4.2.1 实验条件、表格设计及实验结果
• 2.4.2.2 实验结果分析
• 致谢
• 主要参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 图版Ⅰ
• 图版Ⅱ