盾壳霉T-DNA标记插入突变体ZS-1T20440特性研究及其产抗真菌物质相关基因克隆

论文摘要

核盘菌（ScIerotinia sclerotiorum）是一种世界性分布的重要病原真菌。盾壳霉（Coniothyrium motitans）是核盘菌的重寄生真菌，具广阔的应用前景。前人研究表明盾壳霉在特定的培养条件下可以分泌抗真菌物质（antifungal substance，简称AFS），表明该真菌中存在合成抗真菌物质相关的基因。但盾壳霉在PDA上培养时不产生AFS或其含量很低。本研究自盾壳霉T-DNA标记插入突变体库中筛选到一些在PDA上即可产生大量AFS的突变体，并对其中的ZS-1T20440突变菌株进行了较系统的研究。该突变株命名为AFS-PEM（antifungal substance productionenhanced mutant）ZS-1T20440。对突变株ZS-1T20440与出发菌株ZS-1在菌丝生长速度、分生孢子萌发速度、抗细菌物质的产生能力和寄生致腐核盘菌能力等生物学特性进行了比较测定，研究发现：在PDA上ZS-1T20440的分生孢子萌发速度比ZS-1要快，在培养24h和36h时，ZS-1T20440的分生孢子萌发率分别达到65.5％和97.4％，而ZS-1却只有45.3％和84.2％；但是ZS-1T20440菌丝的生长速度比ZS-1慢，ZS-1T20440平均生长速度只有1.23 mm／d，ZS-1平均生长速度达到2.77 mm／d；以水稻白叶枯病菌（Xanthmonas oryzae pv oryzae）为指示菌的抗细菌物质产生测定显示ZS-1T20440能产生抗细菌物质，且与ZS-1没有显著差异；ZS-1T20440寄生致腐核盘菌菌核的能力比ZS-1要弱，用盾壳霉分生孢子浸泡过的菌核在灭菌河沙中22℃培养30天左右，ZS-1完全寄生核盘菌菌核，菌核腐烂指数97％，而ZS-1T20440处理的核盘菌菌核的腐烂指数42％；在PDB中对盾壳霉产抗真菌物质规律的研究发现：随着培养时间的延长，菌丝积累量的增加，盾壳霉培养液的抑菌活性逐渐增强，但到一定程度就趋于平稳；在培养过程中，突变体ZS-1T20440的培养液pH值下降至4.67，而出发菌株ZS．1的培养液pH值却上升至6.29。Southern杂交试验显示在ZS-1T20440中的T-DNA标记为单拷贝：并据此利用反向PCR等方法，对T-DNA插入破坏的目的基因进行了全长克隆，获得了大小为738 bp的目的基因全长编码序列：对该基因序列进行序列分析，并用GeneScan预测其编码245个氨基酸：对推定的氨基酸序列在Genebank上进行同源性比对，与曲霉（Aspergillus fumigatus Af293）的GPI锚定蛋白有较高的同源性，推定ZS-1T20440中被T-DNA标记插入破坏的基因编码类似GPI锚定蛋白，将该基因命名为CMGPI-like 1。Southern杂交试验证实CMGPI-like 1在盾壳霉中为单拷贝：并通过Northern杂交试验证实该基因在出发菌株ZS-1中正常表达，而在突变株ZS-1T20440中检测不到其mRNA，初步认为该基因与盾壳霉产抗真菌物质相关，起负调控作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌重寄生真菌盾壳霉的研究进展
• 1.1 核盘菌及作物菌核病
• 1.2 作物菌核病的防治
• 1.3 生防菌盾壳霉的研究进展
• 1.4 盾壳霉的生物学特性
• 1.5 盾壳霉的生态学特性
• 1.6 盾壳霉控制作物菌核病应用及其规模化生产
• 1.7 盾壳霉的分子生物学研究
• 1.8 盾壳霉与核盘菌的互作
• 2 真菌产抗真菌物质研究
• 3 产抗真菌物质相关基因的克隆策略
• 4 本项研究的意义
• 第二章 盾壳霉产抗真菌物质缺陷型突变体的筛选及突变体ZS-120440的生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 ZS-1T20440菌株的拮抗特性
• 2.2 ZS-1T20440菌株的菌落形态特征
• 2.3 ZS-1T20440菌株的产孢能力
• 2.4 ZS-1T20440菌株分生孢子的萌发
• 2.5 ZS-1T20440菌株的菌丝生长速度
• 2.6 ZS-T20440菌株产抗细菌物质测定
• 2.7 ZS-1T20440菌株寄生致腐菌核的能力
• 2.8 ZS-1T20440菌株产生AFS的规律
• 3 结论与讨论
• 第三章 盾壳霉产抗真菌物质相关基因的克隆及功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 菌丝培养与基因组DNA的提取
• 2.2 ZS-1T20440菌株中T-DNA插入拷贝数的Southern分析结果
• 2.3 利用反向PCR对手DNA侧翼目标序列进行扩增
• 2.4 反向PCR获得的目标基因亚克隆鉴定
• 2.5 反向PCR扩增片段测序列分析序结果
• 2.6 目标基因3’端扩增及亚克隆鉴定
• 2.7 目标基因3’端测序及拼接结果
• 2.8 目的基因同源性比对
• 2.9 CMGPI-like1在盾壳霉中的拷贝数
• 2.10 CMGPI-like1的表达
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢