拟南芥VSP1蛋白酸性磷酸酶活性及初步晶体学研究

论文摘要

植物营养贮存蛋白质（Vegetative Storage Proteins, VSP）作为氮源的临时储备形式,在许多植物中被鉴定出来。这类蛋白在不同的营养贮存器官中能积累到很高的程度。作为氨基酸的临时储备,VSP在植物对氮及其他营养物质需要时被降解。VSP最早从大豆的叶中鉴定出来,为了与种子贮存蛋白相区别而被称为营养贮存蛋白质。拟南芥VSP（包括VSP1和VSP2）是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现的大豆VSP的同源蛋白,二者的氨基酸序列相似性达到40%左右。拟南芥VSP主要存在于花和芽中,能被机械创伤,茉莉酸,昆虫的食草作用,磷酸盐的缺乏,渗透和营养压力诱导。与大豆VSP相比,拟南芥VSP2具有明显的酸性磷酸酶活性,在分类上属于HAD超家族。重组的拟南芥VSP2还具有抗虫的活性,并与其酸性磷酸酶性质有关。然而,拟南芥VSP蛋白的结构尚未有报道,阻碍了人们对其催化机理的全面细致的了解。我们对重组VSP1进行了酶学和晶体学研究,这为VSP1结构的解析,阐明其催化机理打下基础。将拟南芥VSP1-pET-22b质粒转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞,并得到高效表达。经过Ni-NTA亲和层析,得到电泳纯的VSP1蛋白。对重组VSP1进行了酸性磷酸酶性质研究,包括二价铜离子与镁离子的催化差异,底物特异性,抑制剂的影响。不同浓度的二价铜离子与镁离子对VSP1催化活性的影响有所不同。Cu2+浓度为1mM时,VSP1活性最大,然后呈下降趋势；而Mg2+浓度为10 mM时,VSP1活性最大,随后基本保持不变,提示两种离子的激活机制可能不同。VSP1显示狭窄的底物特异性,磷酸芳基酯pNPP和MUP是最易催化的底物,而其他底物的水解速率都在pNPP水解速率的5%以下。磷酸盐对VSP1无明显抑制作用,EDTA,钼酸盐和钒酸盐对VSP1具有显著的抑制作用。Asp124突变体完全丧失酸性磷酸酶活性,表明Asp124为催化功能所必须。利用坐滴气相扩散法并采用Hampton Research Crystal ScreenⅠ&Ⅱ和Emerald BioSystems WizardⅠ&Ⅱ在287 K进行重组VSP1蛋白晶体筛选,在Crystal Screen I的40号条件中得到蛋白晶体,衍射分辨率达到1.9 A。VSP1晶体初步数据显示空间群为C2,晶胞参数为α=123.1 A,b=48.4 A,c=85.6A,α=γ=90°,β=116.3。。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 综述
• 1.1 植物营养贮存蛋白质
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 植物营养贮存蛋白质基因表达的调控
• 1.1.3 植物营养贮存蛋白质的酶学性质
• 1.1.4 拟南芥植物营养贮存蛋白质
• 1.2 Haloacid dehalogenase（HAD）超家族
• 1.3 蛋白质晶体学
• 1.3.1 蛋白质结晶的原理
• 1.3.2 蛋白质晶体生长方法
• 1.3.3 蛋白质晶体生长优化
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 分子生物学试剂
• 2.1.3 生物化学试剂
• 2.1.4 试剂配制
• 2.1.5 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥VSP1蛋白的表达与纯化
• 2+和Mg²⁺对VSP1酸性磷酸酶活性的影响'>2.2.2 Cu²⁺和Mg²⁺对VSP1酸性磷酸酶活性的影响
• 2.2.3 VSP1蛋白底物特异性
• 2.2.4 抑制剂对VSP1活性的影响
• 2.2.5 VSP1 Asp124突变体的构建及其活性测定
• 2.2.6 拟南芥VSP1蛋白的晶体学研究
• 第三部分 实验结果
• 3.1 拟南芥VSP1蛋白的表达与纯化
• 2+和Mg²⁺对VSP1酸性磷酸酶活性的影响'>3.2 Cu²⁺和Mg²⁺对VSP1酸性磷酸酶活性的影响
• 3.2.1 pNPP法测活标准曲线
• 2+和Mg²⁺对VSP1酸性磷酸酶活性的影响'>3.2.2 Cu²⁺和Mg²⁺对VSP1酸性磷酸酶活性的影响
• 3.3 VSP1蛋白底物特异性
• 3.3.1 钼酸铵法测活标准曲线
• 3.3.2 VSP1蛋白底物特异性
• 3.4 抑制剂对VSP1活性的影响
• 3.5 VSP1 Asp124突变体的构建及其活性测定
• 3.5.1 VSP1 Asp124突变体的PCR扩增
• 3.5.2 VSP1 Asp124突变体转化DH5α感受态细胞
• 3.5.3 测序
• 3.5.4 质粒抽提与转化BL21（DE3）
• 3.5.5 VSP1-D124S与VSP1-D124A的试表达
• 3.5.6 VSP1-D124S与VSP1-D124A的表达与纯化
• 3.5.7 VSP1,VSP1-D124S与VSP1-D124A的圆二色谱
• 3.5.8 VSP1-D124S与VSP1-D124A的活性测定
• 3.6 拟南芥VSP1蛋白的晶体学研究
• 第四部分 讨论
• 4.1 拟南芥VSP1蛋白的表达与纯化
• 4.2 拟南芥VSP1酸性磷酸酶性质
• 4.3 拟南芥VSP1蛋白的晶体学研究
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 附录
• 附录一:拟南芥VSP1 mRNA与蛋白序列
• 1.1 拟南芥VSP1 mRNA序列
• 1.2 拟南芥VSP1蛋白序列
• 附录二:测序图谱
• 2.1 VSP1-D124S测序图谱
• 2.2 VSP1-D124A测序图谱
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文