人牙髓细胞在体外增殖和分化潜能的实验研究

论文摘要

保存牙髓活力是牙髓生物学基础研究的主要内容和牙髓病治疗学发展的主要目标。随着分子生物学、组织工程学、细胞生物学等相关学科的发展,牙本质-牙髓复合体的再生已展示出诱人的应用前景和科学价值。本实验通过体外培养hDPCs,观察hDPCs在离体牙髓腔内生长和分化情况,以及EDMPs对hDPCs增殖和分化的影响,以期为组织工程化牙髓的研制提供实验依据。第一部分人牙髓细胞体外培养材料和方法收集因正畸需要新鲜拔除的前磨牙（18～30岁）,无菌条件下劈冠取出牙髓,采用组织块酶解法进行hDPCs的原代培养。传代时制取细胞爬片,通过HE染色来观察细胞形态,同时采用细胞免疫化学染色对细胞来源进行鉴定。另外,通过连续8d细胞计数描绘细胞生长曲线。结果hDPCs体外生长特点为梭形成纤维细胞样,有2～3个突起,免疫化学染色显示细胞浆中波形丝蛋白呈阳性表达,角蛋白无表达,证明细胞为间充质来源。细胞生长曲线近似“S”形,3～7d为对数生长期,经计算,hDPCs的PDt为27.6h。结论实验证实该细胞为hDPCs,体外培养生长稳定,为下一步实验奠定基础。第二部分人牙髓细胞在离体牙髓腔内生长和分化的研究材料和方法收集新鲜拔除的无龋后牙,截取牙冠,慢球钻去除髓腔内壁的前期牙本质层,经10%EDTA、19%柠檬酸、75%乙醇处理后接种hDPCs,培养2周后4%多聚甲醛固定,10%甲酸脱钙约20d后脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,进行HE染色和Masson三色法染色,显微镜下观察。结果hDPCs在经处理后的牙本质表面生长状态良好,部分标本中可见在牙本质表面有3～5层扁平状细胞紧密贴附于牙本质表面生长。在另外部分标本中,细胞排列疏松呈星网状,并可看到细胞伸出明显的突起伸入牙本质小管中。结论通过体外培养,hDPCs在牙本质表面可以表现为成牙本质细胞样细胞的形态,为组织工程化牙髓的研制提供参考。第三部分牙本质基质蛋白对人牙髓细胞增殖和分化的影响材料和方法取生长稳定的第3～5代细胞,制备成细胞悬液后接种至96孔板,分别加入含EDMPs的培养液、矿化诱导液和普通培养液,利用MTT比色法连续8d检测hDPCs的增殖情况;另取生长稳定的第3～5代细胞,制备成细胞悬液后接种至25mL培养瓶,分别加入含EDMPs 10 ug/mL、含EDMPs 1 ug/mL的培养液、矿化诱导液和普通培养液,培养3周后茜素红染色,观察hDPCs的矿化情况。结果MTT比色法结果显示,从第3天起光吸收值EDMPs组＞矿化诱导液组＞普通培养液组,3组的总体差异具有显著性（P＜0.05）。矿化诱导实验结果显示,培养7d左右,含EDMPs 10 ug/mL组、含EDMPs 1 ug/mL组和矿化诱导液组细胞呈复层生长,含EDMPs 10ug/mL组和含EDMPs 1 ug/mL组12d时在漩涡的中心处开始出现致密钙化结节,培养3周后进行茜素红染色,含EDMPs 10 ug/mL组、含EDMPs 1 ug/mL组形成较大的红色钙化结节,矿化诱导液组所形成的钙化结节较小,空白对照组无钙化结节形成。结论EDMPs对体外培养的hDPCs的增殖和分化有一定的作用,为进一步探讨牙髓损伤修复机制和组织工程化牙髓的研制提供参考。

论文目录

• 英文缩写对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 第一部分 人牙髓细胞体外培养
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二部分 人牙髓细胞在离体牙髓腔内生长和分化的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三部分 牙本质基质蛋白对人牙髓细胞增殖和分化的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 学习成绩
• 已发表论文
• 《人牙髓细胞在离体牙髓腔内向成牙本质细胞样细胞分化的研究》
• 《Carisolv对人牙髓细胞的体外毒性研究》
• 《组织工程化牙本质的种子细胞研究进展》
• 致谢