壳聚糖纳米粒介导hTERT-siRNA干扰恶性胶质瘤U251细胞的实验研究

论文摘要

恶性肿瘤是中国内地城乡居民首位死亡原因,而且发病率逐年上升。恶性胶质瘤是临床上最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的40～50%,发病率8～10/10万,且有逐年上升的趋势,中青年人发病率高。世界卫生组织1998年公布按死亡率顺序排位,恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第二位死亡原因,是35～54岁患者的第三位死亡原因。在全球,每年恶性脑胶质瘤无情地夺去18～60万中青年人的宝贵生命。目前脑胶质瘤的基本治疗手段还是手术切除加放疗和化疗。高度弥漫性、浸润性生长的本性排除了胶质瘤完整切除的可能,术后不可避免要复发;而化疗和放疗措施,因敏感性低及胶质瘤对其产生抵抗,并没有提高恶性胶质瘤患者的预后。因此,如何提高胶质瘤的临床治疗效果是神经肿瘤学领域的努力方向;针对恶性胶质瘤的任何新治疗措施,对改善预后都有重要意义。目前为止,治疗肿瘤最理想的目标是彻底消灭肿瘤。从细胞水平来说,意味着尽可能有选择性地消灭肿瘤细胞。但由于并非所有癌基因和癌抑制基因都在肿瘤形成过程中发挥有效作用,信号转导网络系统的存在使得筛选肿瘤关键基因的难度增大,且肿瘤是多基因、多因素疾病,单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果。而RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术能同时抑制多个不同的基因,且抑制效果互不干扰,因此RNAi技术成为应用潜力较大的肿瘤治疗新手段。RNAi是双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）降解特异性靶基因转录出的mRNA、从而抑制靶蛋白表达的现象。根据碱基配对原则以mRNA为靶点能高度特异地阻断蛋白质的表达,从而达到从根本上治疗疾病的目的。自从20世纪九十年代发现RNAi这一现象以来,RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。然而,发挥RNAi作用的21-23nt的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）分子容易被核酸酶降解;而且真核细胞不易摄取外源性裸露核酸,siRNA转染细胞效率低下,必须选择适当的载体包裹siRNA,以免降解并且能够辅助siRNA转染细胞。目前siRNA转运体仍局限于病毒、脂质体、DNA质粒等,这些载体容易引起毒副作用及免疫反应,均不是最佳的基因载体。对于脑胶质瘤来说,还存在血脑屏障,使siRNA难以进入肿瘤细胞。因此,必须寻找合适的载体系统,才能将RNAi从有效地研究工具转化为可行的治疗策略。鉴于壳聚糖所具有的良好生物相容性、生物降解性和抗肿瘤活性,我们选择人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）作为RNAi治疗靶位点,通过纳米技术制备壳聚糖纳米粒,包裹siRNA,使其能有效保护siRNA,并能控制siRNA缓慢释放,并能有效地转染U251细胞,抑制其增殖及生长,促进肿瘤细胞凋亡,达到治疗肿瘤的目的。有望为肿瘤RNAi治疗提供一种新的探索。第一部分:壳聚糖-siRNA纳米粒的制备及其特性目的:探讨离子凝胶法制备壳聚糖（chitosan）-siRNA纳米粒的特点,并分析其理化性质。方法:将壳聚糖、三聚磷酸钠（pentasodium tripolyphosphate,TPP）和针对hTERT基因的siRNA通过离子凝胶法制备壳聚糖-siRNA纳米粒;透射电镜、原子力显微镜观察壳聚糖纳米粒的形态及大小。Zeta电位/粒度分析仪测定壳聚糖纳米粒的平均粒径和Zeta电位;分光光度计测定上清中siRNA含量,计算包封率、siRNA的体外控释能力;凝胶电泳分析壳聚糖-siRNA纳米粒与胎牛血清作用后壳聚糖纳米粒中siRNA的稳定性。结果:离子凝胶法成功制备了壳聚糖-siRNA纳米粒,经电镜和原子力显微镜观察发现纳米粒呈球形,形状一致。Zeta电位/粒度分析仪测定其平均粒径为83.3nm,Zeta电位+24.2mv;包封率为95%;壳聚糖-siRNA纳米粒中siRNA缓慢释放,释放曲线呈“S”形,24h内siRNA的体外释放率不足20%;电泳结果表明壳聚糖-siRNA性质稳定,能够阻止胎牛血清中RNase对siRNA的降解,具有保护siRNA的作用。结论:离子凝胶法可制备粒度分布均匀,形态规则,具有较高包封率的壳聚糖-siRNA纳米粒。壳聚糖-siRNA纳米粒能控制siRNA缓慢释放,并且对siRNA具有酶解保护作用,适合作为基因递送载体。第二部分:壳聚糖-小干扰RNA纳米粒转染恶性胶质瘤细胞U251的体外实验研究目的:观察靶向端粒反转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因的壳聚糖（chitosan）-小干扰RNA（small interferening RNA,siRNA）纳米粒在体外进行RNA干扰对胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。方法:1.壳聚糖-siRNA纳米粒及空白壳聚糖纳米粒的制备同第一部分。2.实验分组:按转染试剂的不同分为8组,每组3复孔或5复孔。A组:空白对照组（不含转染试剂及siRNA）;B组:阳性对照组(LipofectamineTM 2000转染siRNA);C组:阴性对照组（含3 mmol/L阴性对照siRNA的纳米粒）;D组:裸siRNA对照组（含3 mmol/L siRNA）;E组:空白壳聚糖纳米粒对照组;F、G、H组:分别含1,3,9 mmol/L siRNA纳米粒组。3.U251细胞传代培养。4.取对数生长期的U251细胞转染。5.转染后48小时,在培养状态下,用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变。6.Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色后,荧光显微镜下观察凋亡细胞核形态。7.碘化丙啶（PI）一步荧光染色法检测细胞周期。8.流式细胞仪观察细胞凋亡情况。9.采用CCK-8法检测细胞增殖并绘制细胞增殖曲线及计算增殖抑制率。10.RT-PCR法检测各组细胞中hTERT-mRNA表达变化。结果:1.倒置显微镜下空白对照组、阴性对照组,裸siRNA对照组、空白壳聚糖纳米粒对照组细胞呈上皮型贴壁生长,为梭形,细胞轮廓清楚、透明度大,颗粒较少,生长状态良好,细胞间结构紧密。阳性对照组和1、3、9mmol/L纳米粒组细胞均有部分变圆浮起,细胞间接触变松,增殖减慢,细胞中颗粒增多,部分细胞周围碎片增多,生长状态总体欠佳。2.Hoechst 33342/碘化丙啶双染荧光显微镜下可见空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组和空白壳聚糖纳米粒对照组大多为低蓝色的正常细胞;阳性对照组、1、3、9 mmol/L siRNA纳米粒组以高蓝色的凋亡细胞为主。3.各组细胞间期结果分别比较,G0/G1期差异有统计学意义（F=46.850,P=0.000）,S期差异亦有统计学意义（F=47.964,P=0.000）,G2/M期细胞变化不明显（F=2.532,P=0.059）。阳性对照组、1、3、9 mmol/L siRNA纳米粒组与空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组、空白壳聚糖纳米粒对照组相比,G0/G1期细胞显著增加,S期细胞明显减少,阳性对照组最为明显（P＜0.05）。4.各组细胞间凋亡率有显著性差异（F=1192.251,P=0.000）。阳性对照组、1、3、9 mmol/L siRNA纳米粒组与空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组、空白壳聚糖纳米粒对照组相比,有显著性差异。1 mmol/L siRNA纳米粒组与3、9mmol/L siRNA纳米粒组凋亡率有显著差异,3 mmol/L与9 mmol/L siRNA纳米粒组间凋亡率无统计学意义。5.CCK-8结果表明,各组间吸光度有显著性差异（F=38.639,P=0.000）,阳性对照组、3,9 mmol/L siRNA纳米粒组细胞增殖明显受抑制,吸光度值减小,与其余各组比较差异有显著性（P＜0.05）。6.RT-PCR结果显示各组间hTERT mRNA相对表达水平差异有统计学意义（F=1218.959,P=0.000）,阳性对照组、3、9 mmol/L siRNA纳米粒组hTERT mRNA表达明显下调,3、9 mmol/L siRNA纳米粒组表达下调较1 mmol/L siRNA纳米粒组更明显。结论:壳聚糖-siRNA在体外能够抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进其凋亡。壳聚糖-siRNA纳米粒对U251生长抑制没有明显剂效关系,3 mmol/L壳聚糖-siRNA作用效果较好。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 壳聚糖-siRNA纳米粒的制备及其特性
• 引言
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 4、小结
• 5、参考文献
• 6、附图
• 第二部分 壳聚糖-小干扰RNA纳米粒转染恶性胶质瘤细胞U251的体外实验研究
• 引言
• 1、材料与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 4、小结
• 5、参考文献
• 6、附图
• 全文小结
• 综述
• 英文缩略词对照表
• 在读期间的学习成果
• 致谢