食源性肥胖大鼠和肥胖抵抗大鼠下丘脑的蛋白组学研究

论文摘要

随着人们生活水平的提高,肥胖人口在全球范围内不断增多,肥胖诱发的相关疾病也日趋严重,威胁着人类的健康,加重了社会负担。肥胖的产生主要是由于摄入的热量过多,在体内形成脂肪堆积造成的。在维持机体能量平衡的过程中,下丘脑发挥了关键的作用。前期研究发现,下丘脑能够释放具有刺激或抑制摄食作用的神经多肽,如神经肽Y （NPY）和a-黑色素细胞刺激促激素（a-MSH）等,通过调控摄食行为维持机体能量平衡。随着研究的深入,不断有新的信号蛋白被发现对肥胖的产生发挥了重要作用,以往的理论已不能完全解释肥胖产生的原因。目的：本研究旨在通过对DIO和DR大鼠下丘脑的蛋白组学研究,筛选并鉴定下丘脑差异表达的蛋白质,揭示下丘脑内摄食相关蛋白质和神经肽在肥胖发展过程的作用,为肥胖的防治提供新的靶标。方法：1.建立DIO-DR大鼠模型。2.采用双向凝胶电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis,2DE）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）的技术筛选并鉴定DIO-DR大鼠下丘脑差异表达的蛋白质。3.进一步运用荧光差异双向电泳（two-dimensional differential in-gel eletrophoresis,2D-DIGE）结合串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）的技术筛选并鉴定DIO-DR大鼠下丘脑差异表达的蛋白质。4.利用免疫组化和western blotting的方法对DIO-DR大鼠下丘脑部分差异表达蛋白质（包括PDI、GSTM1、SNAP-25等）进行定位和定量的检测,并对其功能展开深入研究。结果：.DIO和DR大鼠表型差异：1.DIO大鼠与DR大鼠初始体重相当,给予高脂饮食后,DIO大鼠体重增长速度快于DR大鼠,每日平均摄食量多于DR大鼠。2.DIO大鼠腓肠肌、睾丸和心脏的重量与DR大鼠相当,而内脏脂肪含量如附睾、肾周脂肪重量明显高于DR大鼠。3.DIO大鼠的甘油三酯、自由脂肪酸水平高于DR大鼠,而DR大鼠与普通饲料对照组水平相当。4. Elisa检测发现在肥胖早期（4周）和中期（8周）DIO大鼠的血清瘦素、胰岛素水平与对照组和DR组相比没有明显差异；而在肥胖后期（14周）DIO大鼠血清瘦素、胰岛素水平明显高于DR组（p<0.05）,DR大鼠水平与对照组无显著性差异,提示DIO大鼠长期高脂喂养后出现瘦素抵抗和胰岛素抵抗。二.2DE结合质谱技术对DIO-DR大鼠下丘脑进行差异表达蛋白质的筛选和鉴定：1.筛选并鉴定出22种蛋白质,其中7种在DIO组呈高表达,7种下调,6种在DR组高表达,6种下调。2.这22种蛋白质分别属于抗氧化蛋白（PRDX1, GSTM1）、细胞代谢相关蛋白（UCHL-1X）、细胞周期调控蛋白、细胞骨架蛋白及未知蛋白等不同类别。三.2D-DIGE结合串联质谱对DIO-DR大鼠下丘脑进行差异表达蛋白质的筛选和鉴定：1.运用2D-DIGE筛选出42个蛋白质点,运用串联质谱技术（MALDI-TOF-MS/MS）鉴定出33种蛋白质,其中DIO组与对照组相比表达上调的有9个,下调的有2个；DIO组与DR组相比表达上调的有8个,下调的有9个；DR组与对照组相比上调的有8个,下调的有4个。2.将2D-DIGE结合串联质谱技术与2DE结合质谱技术进行比较发现,2D-DIGE所需样品量少,敏感性和特异性更高,筛选出更多的差异蛋白质点。而串联质谱技术也比一级质谱鉴定出更准确的蛋白质结构,得到更信服的结果。这33个蛋白质其中部分与2DE结合一级质谱的鉴定结果相一致,主要包括抗氧化蛋白、分子伴侣、细胞代谢相关蛋白、突触相关蛋白、细胞骨架蛋白等几个类别,其中抗氧化蛋白1（PRDX1X）、谷胱甘肽转移酶1（GSTM1X）、二硫键异构酶（PDI）、泛素C末端水解酶L1 （UCHL1）等可能与肥胖的发生有密切的联系,并发现了动力蛋白1（Dynamin 1）和SNAP-25等新的信号蛋白。四.免疫组化和western boltting方法对差异蛋白质进行定位和定量的研究1.免疫组化发现PDI、PRDX1和Dynamin1在DIO大鼠下丘脑阳性表达增强；SNAP-25在DIO大鼠下丘脑表达下调,在DR大鼠下丘脑表达上调。2. western blotting检测发现Dynamin1在DIO组表达上调,与对照组和DR组相比具有显著性差异；PDI、PRDXl和GSTM1在DIO组表达上调且在DR组表达下调（与对照组相比）;UCHL-1和SNAP-25在DIO组表达下调且在DR组表达上调（与对照组相比）。结论：1.成功建立了DIO-DR大鼠模型,与人类肥胖具有很多相似的特征。2.通过蛋白质组学的研究,成功筛选和鉴定了DIO和DR大鼠下丘脑差异表达蛋白,而DIGE技术的应用,发掘了更多肥胖相关的信号分子,为深入研究肥胖的发病机制奠定了基础。3.DIO大鼠下丘脑由于长期高脂饮食发生细胞应激反应（氧化应激和内质网应激）,干扰了瘦素和胰岛素的信号转导通路,造成DIO大鼠瘦素抵抗和胰岛素抵抗,并进而发展为肥胖。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、DIO-DR大鼠模型的建立
• 前言
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 建立动物模型
• 1.1.2 动物饲料
• 1.1.3 大鼠下丘脑的提取
• 1.1.4 Elisa测定大鼠瘦素、胰岛素含量
• 1.2 结果
• 1.2.1 高能饲养后大鼠体重的变化
• 1.2.2 高能饲养后大鼠内脏重量的变化
• 1.2.3 Elisa测定大鼠瘦素、胰岛素的含量
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、2-DE结合质谱技术筛选差异表达蛋白质点及生物信息分析
• 前言
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 大鼠下丘脑总蛋白的提取
• 2.1.2 蛋白定量
• 2.1.3 双向电泳
• 2.1.4 图像分析
• 2.1.5 胶内酶解
• 2.1.6 质谱分析
• 2.1.7 数据库检索
• 2.2 结果
• 2.2.1 Bradford法检测样本蛋白定量的结果
• 2.2.2 下丘脑蛋白质组的2-DE差异分析
• 2.2.3 差异蛋白质点的质谱鉴定及数据库检索
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、2D-DIGE结合串联质谱筛选差异表达蛋白质点及生物信息分析
• 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 样品制备和蛋白定量
• 3.1.4 荧光差异双向电泳
• 3.1.5 固定与染色
• 3.1.6 图像扫描
• 3.1.7 图像分析
• 3.1.8 质谱分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 Bradford法检测样本定量结果
• 3.2.2 下丘脑蛋白质组的2D-DIGE差异分析
• 3.2.3 差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定及数据库检索
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 四、下丘脑差异表达蛋白与DIO、DR的相关性研究
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 Western Blotting检测下丘脑差异蛋白质的表达
• 4.1.2 免疫组织化学研究
• 4.1.3 实验数据处理和统计学分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 Western Blotting检测下丘脑差异蛋白质的表达
• 4.2.2 免疫组化方法检测下丘脑差异蛋白质的表达
• 4.3 讨论
• 4.3.1 下丘脑与瘦素、胰岛素的关系
• 4.3.2 肥胖与氧化应激
• 4.3.3 肥胖与内质网应激
• 4.3.4 突触相关蛋白与肥胖的关系
• 4.3.5 泛素蛋白酶体系统与肥胖
• 4.3.6 其他差异表达蛋白质与肥胖之间的关系
• 4.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 肥胖与细胞应激
• 综述参考文献
• 致谢