多氧霉素与尼可霉素的代谢工程与组合生物合成研究

论文摘要

多氧霉素与尼可霉素作为几丁质合成酶的特异性抑制剂，不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。这两个抗生素的化学结构较为相似，都是由一个或两个独立合成的肽基与一个核苷骨架在不同位置组装而成。此外，这两个抗生素的生物合成基因簇中相关基因同源性也较高。基于此，我们设计了四个多氧霉素与尼可霉素的杂合抗生素。本研究首先克隆了唐德链霉菌中尼可霉素的生物合成基因簇，并根据杂合抗生素的化学结构需要，运用PCR打靶技术对特定尼可霉素生物合成基因进行敲除，突变后的黏粒接合转移入改造过的多氧霉素工业菌株中进行异源表达。通过对抗生素产生菌的生物合成途径进行改造，得到若干重组菌株。重组菌株的发酵产物纯化后经质谱和核磁共振分析，确定得到了目标的四个杂合肽核苷类抗生素(polyoxin N, nikkoxin B, nikkoxin C andnikkoxin D)的定向产生。本研究所产生的四个杂合抗生素对多数参与测试的人类或植物病原真菌具有良好的抑制作用。其中nikkoxin D对于人类条件致病菌皮状丝孢酵母的抗菌活性与天然抗生素相比有显著提高，因而具有潜在的临床开发价值。这项研究为利用代谢工程与组合生物合成策略，对原有生物合成途径进理性化改造而产生的新型肽核苷类抗生素提供了良好的范例。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 第一节 前言
• 1.1 微生物来源的天然产物
• 1.2 提高天然产物多样性的传统策略
• 1.3 代谢工程与组合生物合成策略
• 第二节 多氧霉素与尼可霉素生物合成的研究进展
• 2.1 多氧霉素研究进展
• 2.2 尼可霉素研究进展
• 2.3 多氧霉素与尼可霉素结构改造的研究进展
• 第四节 本课题的研究目的与意义
• 4.1 本课题研究目的
• 4.2 本课题的研究意义
• 第二章 材料与方法
• 第一节 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 质粒
• 1.3 引物及序列
• 1.4 培养基和溶液
• 第二节 实验方法
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 杂合抗生物产生的可行性分析
• 1.1 多氧霉素与尼可霉素的化学结构对比
• 1.2 多氧霉素与尼可霉素生物合成基因簇的对比
• 1.3 多氧霉素与尼可霉素可能形成的杂合抗生素
• 第二节 抗生素生物合成途径改造
• 2.1 杂合抗生素的生物合成通路设计
• 2.2 尼可霉素生物合成基因簇改造
• 2.3 多氧霉素工业菌株突变株构建
• 第三节 重组菌株构建与代谢产物分析
• 3.1 重组菌株 ZLP3 的构建与代谢产物分析
• 3.2 重组菌株 ZLP2 的构建与代谢产物分析
• 3.3 重组菌株 ZLP6 的构建与代谢产物分析
• 第四节 杂合抗生素的结构解析
• 4.1 杂合抗生素的高分辨质谱解析
• 4.2 杂合抗生素的核磁共振解析
• 第五节 杂合抗生素的生物活性检测
• 第四章 总结与展望
• 第一节 本研究总结与主要创新点
• 1.1 研究总结
• 1.2 主要创新点
• 第二节 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表的论文