转拟南芥FAD8基因油菜脂肪酸代谢及抗寒性的研究

论文摘要

油菜是重要的油料经济作物，利用基因工程手段调控其脂肪酸代谢途径，改善油脂膳食营养，提高植株抗逆性是目前油料作物改良的重点。拟南芥脂肪酸脱饱和酶FAD8基因编码叶绿体ω—3脂肪酸脱饱和酶，该酶在低温下催化二烯酸迅速脱饱和产生三烯酸，该酶可显著提高植物中不饱和脂肪酸含量，增强种子油脂营养价值及植株对低温的适应力。本研究建立了油菜高效转化体系，利用本实验室克隆的拟南芥FAD8基因构建正义和反义表达载体遗传转化油菜。筛选转基因植株研究了FAD8基因脂肪酸代谢和抗寒性的影响，获得较好的结果。1、以甘蓝型油菜特选4号下胚轴及子叶为转化受体材料，研究基因型、苗龄、激素组合及浓度、取材时间、培养时间、外源基因等因素对其转化效率的影响，确定最适的分化培养基为：MS+6-3mg／L BA+0.1mg几NAA。在添加0.1mg／L2，4-D的MS培养基中预培养3d，重悬5倍的菌液中浸染转化（下胚轴30s；及子叶5min），转化后再经2d共培养、6d脱菌培养后进行筛选培养转化效率较高。2、采用农杆菌介导法将FAD8基因（载体为pSH-FAD8、Psh-anti-FAD8）遗传转化油菜下胚轴、子叶、子叶柄等外植体，并获得转基因植株。经徒手切片GUS染色检验出阳性植株，再经PCR及RT-PCR鉴定，进一步检测出7株转化正义FAD8基因植株，9株转化反义FAD8基因植株。3、提取油菜脂肪酸进行反相薄层层析及气相色谱分析，结果表明转化反义FAD8基因叶片中亚麻酸降低，油酸及亚油酸均有不同程度提高，转化正义FAD8基因叶片中仅有1株亚麻酸提高。转化正义及反义FAD8基因F1代种子均获得60％以上的高油酸含量，可做为油菜品种改良的新材料。4、叶片离体抗寒实验结果表明，转基因植株抗寒性明显高于对照。筛选出两个抗寒能力最强的转基因油菜单株，其F1代植株进行抗寒性鉴定：叶绿素含量、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、丙二醛含量、脯氨酸含量等均反映出转化FAD8基因植株的抗寒性显著增强。5、转基因植株在田间可正常生长并开花结实，但转FAD8植株现蕾及抽薹期比对照推迟70d，转anti-FAD8植株比对照推迟40d。转基因植株叶型、叶片组织、株高、株型均有改变，部分薹茎自然扭曲。转基因植株还出现雄性不育的性状。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 植物脂肪酸合成机理
• 1.1 脂肪酸的从头合成过程
• 1.2 植物不饱和脂肪酸的生物合成
• 1.3 脂肪酸合成的终止及转运
• 2 植物脂肪酸脱饱和酶的研究进展
• 2.1 植物脂肪酸脱饱和酶的分类
• 2.2 植物脂肪酸脱饱和酶的进化
• 2.3 植物脂肪酸脱饱和酶结构
• 2.4 拟南芥ω-3脂肪酸脱饱和酶
• 3 多不饱和脂肪酸的营养价值
• 3.1 多不饱和脂肪酸抑制血栓的形成
• 3.2 多不饱和脂肪酸降低血压及胆固醇含量
• 3.3 多不饱和脂肪酸促进幼儿视力及大脑发育
• 3.4 多不饱和脂肪酸抗癌作用
• 4 提高植物中多不饱和脂肪酸的基因工程
• 4.1 棕榈酸降低的基因工程
• 4.2 提高油酸的基因工程
• 4.3 提高亚麻酸的基因工程
• 5 油菜转化的基因工程
• 5.1 油菜的转化受体系统
• 5.2 油菜的基因转化方法
• 5.3 油菜转化基因的应用
• 6 植物抗冷的基因工程
• 6.1 植物冷害对细胞膜的影响
• 6.2 不饱和脂肪酸与冷害的关系
• 6.3 植物抗寒基因
• 6.4 ω—3脂肪酸脱饱和酶基因增强植物抗寒性
• 第二部分 实验部分
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.1.3 主要试剂及配方
• 1.1.4 基本培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 无菌材料的准备
• 1.2.2 影响油菜再生及遗传转化因素的研究
• 1.2.2.1 苗龄对对油菜再生的影响
• 1.2.2.2 激素组合及浓度对油菜再生的影响
• 1.2.2.3 卡那霉素对油菜再生的影响
• 1.2.2.4 预培时间对油菜遗传转化的影响
• 1.2.2.5 浸染时间对油菜遗传转化的影响
• 1.2.2.6 共培养时间对油菜遗传转化的影响
• 1.2.2.7 基因型对油菜遗传转化的影响
• 1.2.2.8 外植体选择对对油菜遗传转化的影响
• 1.2.2.9 外源基因对油菜转化分化效率的影响
• 1.2.2.10 抑制剂对油菜转化分化效率的影响
• 1.2.2.11 培养时间对油菜转化分化效率的影响
• 1.2.3 农杆菌介导油菜遗传转化的研究
• 1.2.3.1 目的基因载体导入农杆菌
• 1.2.3.2 农杆菌介导油菜遗传转化
• 1.2.3.3 转基因油菜检测
• 1.2.3.3.1 GUS活性检测
• 1.2.3.3.2 基因组PCR检测
• 1.2.3.3.3 RT-PCR检测
• 1.2.4 转基因油菜成份分析
• 1.2.4.1 叶片脂肪酸反向薄层层析
• 1.2.4.2 脂肪酸成份气相色谱分析
• 1.2.5 转基因油菜植株抗寒性研究
• 0油菜叶片离体抗寒实验'>1.2.5.1 T₀油菜叶片离体抗寒实验
• 1代植株抗寒性研究'>1.2.5.2 T₁代植株抗寒性研究
• 1代植株抗寒生理指标检测'>1.2.5.3 T₁代植株抗寒生理指标检测
• 1.2.6 田间转基因油菜生长差异比较
• 2 结果与分析
• 2.1 影响油菜再生因素的研究
• 2.1.1 苗龄对油菜再生的影响
• 2.1.2 激素组合及浓度对油菜再生的影响
• 2.1.3 卡那霉素对油菜遗传转化的影响
• 2.1.4 预培养时间对油菜遗传转化的影响
• 2.1.5 浸染时间对油菜转化的影响
• 2.1.6 共培时间对油菜遗传转化的影响
• 2.1.7 基因型对油菜遗传转化的影响
• 2.1.8 外植体取材对油菜遗传转化的影响
• 2.1.9 外源基因对油菜遗传转化的影响
• 2.1.10 抑制剂对油菜转化分化效率的影响
• 2.1.11 培养时间对油菜转化分化效率的影响
• 2.2 农杆菌介导油菜遗传转化的研究
• 2.2.1 转化体系的确定
• 2.2.1 转基因油菜的获得
• 2.2.2 转基因油菜的检测
• 2.2.2.1 GUS活性检测
• 2.2.2.2 基因组PCR检测
• 2.2.2.3 RT-PCR检测
• 2.3 转基因油菜脂肪酸成分分析
• 2.3.1 反向薄层层析检测
• 2.3.2 油菜叶片脂肪酸气相色谱检测
• 2.3.3 油菜种子脂肪酸气相色谱检测
• 2.4 转基因油菜抗寒性实验
• 0油菜叶片离体抗寒实验'>2.4.1 T₀油菜叶片离体抗寒实验
• 1代油菜植株抗寒性实验'>2.4.2 T₁代油菜植株抗寒性实验
• 1代植株抗寒生理指标检测'>2.4.3 T₁代植株抗寒生理指标检测
• 2.4.3.1 叶绿素含量测定
• 2.4.3.2 超氧物歧化酶（SOD）活性的测定
• 2.4.3.3 过氧化氢酶（CAT）活性的测定
• 2.4.3.4 过氧化物酶（POD）活性的测定
• 2.4.3.5 脯氨酸含量的测定
• 2.4.3.6 丙二醛（MDA）含量的测定
• 2.4.3.7 叶片组织扫描电镜观察
• 2.5 田间转基因油菜农艺学性状调查
• 2.8.1 转基因油菜生育期调查
• 2.8.2 越冬期形态调查
• 2.8.3 抽薹期形态调查
• 2.8.4 收获期经济指标调查
• 2.8.5 转基因油菜雄性不育性状
• 第三部分 分析与讨论
• 1 影响油菜再生及转化的因素
• 1.1 基因型对油菜再生及转化的影响
• 1.2 激素对油菜再生及转化的影响
• 1.3 外植体对油菜再生及转化的影响
• 1.4 抑制剂对油菜再生及转化的影响
• 1.5 抗生素筛选对油菜再生及转化的影响
• 2 转拟南芥FAD8基因对表达油菜脂肪酸代谢的影响
• 3 转拟南芥脂肪酸脱饱和酶基因对油菜植株抗寒性的影响
• 4 转拟南芥脂肪酸脱饱和酶基因油菜雄性不育性状
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 硕士研究生期间参与的工作
• 附录2 油菜种子脂肪酸检测色谱
• 图版