可控性球形多孔β-TCP支架内部血管化规律的研究

论文摘要

迅速而有效的血运重建是构建大块组织工程骨的先决条件。支架内新生的血管有以下作用:①为支架材料深部的细胞提供存活所必需的养分和氧气;②血供系统可向支架内部输送生长因子、钙离子等,刺激未分化的间充质细胞形成成骨细胞,间接影响新骨生成;③有研究报道血流量可调控矿物质沉积。因缺乏血液供应,目前组织工程骨均较小,无法满足临床需要。因此,研究支架材料的血管化规律具有重要意义。目前,组织工程骨血管化的研究侧重两个方面:一是对支架材料施加外来影响因素,如复合血管内皮细胞、生长因子或显微外科血运重建;二是从支架材料本身着手,寻找适宜血管生长的最优结构。然而,支架内部血管生长的规律还知之甚少,尤其缺乏具体的量化数据。同时,以往研究的支架材料大多为圆片状、长方体或颗粒状等,外形及内部结构不规则,孔隙大小不均一,内连接孔较小,不同方向上组织的长入存在差异性,而且不同的观察切面其结果也存在差异,最终的结论并不一致。本课题的目的是研究三维孔隙结构影响下的机体组织血管生长的规律,得出具体的血管生长的量化参数,如血管形成的速度、数量、直径、面积等参数,有助于将前述的两种促进人工骨血管化的方法有机结合,如改进支架结构,优选在支架上接种种子细胞的数量和时机。获得支架内部血管化的量化数据是本研究的创新点之一。实验材料为可控性球形多孔β-TCP支架,因球体规则,无各向异性,组织长入和观察研究不受方向的影响;材料内部微结构完全可控,具有均一的球形孔隙,孔壁光滑,孔隙连通率>99%,大孔和内连接孔直径控制在前期比较研究得出的最佳范围。该球形支架的设计和参数是其他研究所没有的,具有创新性。实验方法上,通过不脱钙硬组织切片下图像采集,基于分数几何体概念将三维参数用二维数据表现,减小了组织形态测定中可能出现的误差,是本研究的另一创新点。本课题由两部分组成,第一部分,定性研究球形多孔β-TCP支架植入体内后,机体组织对其的生物学响应,以了解此材料是否适于血管化的研究。方法:术后1、2、4、8、12周取材,进行脱钙组织切片HE染色、丽春红三色染色,硬组织切片Van Gieson’s苦味酸-品红染色,扫描电镜检查。结果:术后1周细胞迁入;2周出现胶原纤维和幼稚的血管芽;4周时血管、胶原纤维数量增多;8周时大孔周边出现新月形新生骨和类骨质;12周时材料明显降解,组织内见成熟的血管及骨组织。小结:所用球形多孔β-TCP支架具有良好的生物学性能,适于血管化的研究。其内成骨过程为膜内成骨,血管直径受内连接孔限制。第二部分,量化分析球形多孔β-TCP支架内部的血管化过程。采用与第一次实验相同的实验材料植入兔腰背肌肉筋膜袋中,术后1、2、4、8、12周取材,过球体中心做硬组织切片,Van Gieson’s染色,16倍镜下在随机设定的x、y轴取4个区域,50倍镜下在上述四个区域中随机取4个视野,用Leica MTLA全自动专业研究级显微镜（德国Leica公司）进行图像采集,得到16张图片。每个图像中测量血管数、血管直径、组织长入深度比例、血管面积相对百分比等参数,并将16个视野的数据求均值得到每张切片的相应参数值,进行统计学分析。结果:术后2w出现幼稚的血管芽,4w时为血管化的第一个高峰,与2w比血管数量增加（P<0.05）,8w时血管数及直径增加,但无统计学意义（P>0.05）,12w时为第二次血管化高峰,见粗大成熟的血管,与其他时间比血管直径增大（P<0.05）,管壁增厚,有分支血管出现,但是血管数量变化不大（P>0.05）。小结:此种特定支架内部血管生长呈现“双峰型”模式,即血管化分两阶段进行,4w内以细小的幼稚血管快速增加为主,血管直径保持在50～70μm;12w时血管数量变化不明显,但血管直径增大显著,甚至>200μm,塑形改造为成熟血管。“双峰型”血管化模式的意义在于构造组织工程骨的早期,应复合大量的血管内皮细胞或前体细胞,并能持续成活至4w,以生成大量的血管芽;至12w,支架材料应能适度降解,使孔径和内连接径增大以适应血管增粗的需要。结论:本课题研究所用的可控性球形多孔?-TCP支架具有良好的生物学性能,适于血管化的研究。定性及定量分析显示,支架内部血管生长呈现“双峰型”模式,即血管化分两阶段进行:4w内以细小的幼稚血管快速增加为主,血管直径保持在50～70μm;12w时血管塑形改造,直径增大显著,血管数量保持恒定。

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缩略语表

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前言

文献回顾

正文

实验一球形多孔β-TCP支架的生物学性能观察

1 材料

1.1 支架材料

1.2 器械

1.3 实验动物

1.4 麻醉药品

2. 方法

2.1 实验分组

2.2 材料埋植手术

2.3 观察

3. 结果

3.1 大体观察

3.2 组织切片观察

3.3 扫描电镜观察（SEM）

4. 讨论

5. 小结

实验二球形多孔β-TCP支架的体内血管化的量化分析

1. 材料