凝乳酶高产菌株的诱变选育及其发酵条件、产物酶学活性的相关研究

论文摘要

凝乳酶最初发现于未断奶小牛的第四胃,是乳酪制造业中的关键性酶,同时在其他食品、医药、轻工业等领域都有应用,其在酶工业中所占的产值比例高达15%。近年来由于全球性小牛短缺,人们逐渐将目光投向牛凝乳酶的代用品,其中,微生物凝乳酶以其优秀的凝乳性状和便捷的生产工艺受到了最广泛的关注。英、美、荷、日等国率先开始了微生物凝乳剂的相关研究,我国在80年代初亦开始进行相关研究,但目前还缺乏形成产业化的凝乳酶生产工艺,生产乳酪所需的凝乳酶主要依赖于进口,因此进行凝乳酶的相关研究具有较高的经济和社会意义。本文主要进行了微生物发酵产凝乳酶的相关研究,内容包括：凝乳酶高产菌株的诱变选育,发酵产凝乳酶培养基及培养条件的优化以及产物分离方法和酶学活性的初步研究。诱变实验以购自ATCC的米黑毛霉、购自CICC的黑曲霉为出发菌株,分别对其依次进行紫外线照射诱变、脱氧胆酸钠诱变和常压低温等离子体诱变。以产物凝乳活性和非特异性蛋白水解活性为考量标准,通过平板初筛和摇瓶发酵复筛,最后选育一株凝乳酶产量高,蛋白质水解活力小的黑曲霉突变株L-2-12。以该菌株作为发酵生产菌株,产物中凝乳酶产量是原始黑曲霉菌株的4.28倍；是原始米黑毛霉菌株的3.39倍。遗传稳定性试验结果表明,该诱变株基本保持产酶性状稳定。后续实验以该菌株作为研究对象,试验菌株使用干燥沙土管法低温保存。微生物发酵是一个复杂的生理生化过程,不同菌株处于不同营养环境和培养条件下,菌体的代谢均会不同从而影响产酶,因此要提高酶产量,对发酵产酶的条件进行优化是必不可少的一环。经过对发酵培养基营养组分和培养条件的单因素分析和发酵条件的Box-Behnken实验研究,本文最终确立的培养条件为：每250mL锥形瓶分装9g麸皮、1g面粉、0.1g脱脂乳粉,用15mL酸性无机离子营养液（按质量体积比配制0.7％MgSO4·7H2O、0.9％FeSO4·7H2O、0.1％脯氨酸溶液,加0.2NHCl调节pH至6.61）浸润,混匀并高温灭菌,待凉后接种,37℃培养98h。经过一系列优化,发酵产物浓缩冻干后的凝乳酶活性最高可达21000SU。另外,实验对从发酵产物中分离纯化凝乳酶粗酶的方法进行了初步探索。凝乳酶在水溶液中不稳定极易降解,因此初提取时,在充分发酵后即以水为溶剂,使用三步固液反相接触萃取法从固体培养基中萃取出发酵产物,经过离心过滤后,迅速通过真空旋转蒸发的方式浓缩粗酶液,冻干成粗酶粉。通过此方法得到粗酶粉设备简单、便于操作且收率较高,适用于大规模工业化生产。对凝乳酶粗产品进行酶学性质的研究,结果表明该凝乳酶合适的反应温度区间为45-50℃,最适反应pH区间为5.8-6.2；室温（25℃）放置48h酶活基本不变,50℃以下放置凝乳酶超过1h基本无酶活损失。Ca2+的存在对酶的活性有明显的促进作用,凝乳反应中最佳Ca2+添加量为0.1%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 奶酪简介、营养价值及其适用人群
• 1.2 凝乳酶的生理功能及实际应用
• 1.2.1 凝乳酶在牛奶凝结中所起的作用
• 1.2.2 凝乳酶在血管增殖中的作用
• 1.2.3 凝乳酶用于髓核化学溶解疗法
• 1.2.4 凝乳酶的其他应用
• 1.3 凝乳酶的理化性质、结构及凝乳机理
• 1.4 凝乳酶的来源及生产现状
• 1.4.1 动物性凝乳酶
• 1.4.2 植物性凝乳酶
• 1.4.3 微生物源凝乳酶
• 1.5 评价微生物酶产量及活性的测定方法
• 1.6 常压低温等离子体育种
• 1.7 固体发酵技术
• 1.8 本课题的研究意义和内容
• 1.8.1 研究意义
• 1.8.2 研究内容
• 第二章 凝乳酶高产菌株的选育和分离
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器设备
• 2.2.1 菌种与试剂
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌种的保藏
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 孢子悬液的制备
• 2.3.2 紫外（UV）诱变
• 2.3.3 脱氧胆酸钠诱变
• 2.3.4 常压低温等离子体诱变
• 2.3.5 优良菌株的筛选
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 紫外（UV）诱变
• 2.4.2 脱氧胆酸钠诱变
• 2.4.3 常压低温等离子体诱变
• 2.5 小结
• 第三章 发酵产凝乳酶发酵培养基的优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 发酵产物酶活力的测定
• 3.3.2 不同种类基础培养基（碳源）对发酵产酶的影响
• 3.3.3 氮源种类及浓度对产酶的影响
• 3.3.4 无机离子对产酶的影响
• 3.3.5 氨基酸添加对产酶的影响
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 不同种类培养基对发酵产酶的影响
• 3.4.2 添加氮源种类及浓度对发酵产酶的影响
• 3.4.3 无机离子对产酶的影响
• 3.4.4 氨基酸添加对微生物发酵产酶的影响
• 3.5 小结
• 第四章 发酵产凝乳酶培养条件的优化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 发酵产物酶活力的测定
• 4.3.2 发酵时间对发酵产酶的影响
• 4.3.3 发酵温度对产酶的影响
• 4.3.4 初始pH对产酶的影响
• 4.3.5 接种量对产酶的影响
• 4.3.6 发酵条件的Box-Behnken实验设计
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 发酵时间对发酵产酶的影响
• 4.4.2 培养温度对发酵产酶的影响
• 4.4.3 初始pH对产酶的影响
• 4.4.4 接种量对产酶的影响
• 4.4.5 发酵条件的Box-Behnken实验结果
• 4.5 小结
• 第五章 发酵产物中凝乳酶酶学性质的初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 发酵产物中凝乳酶的初步分离
• 2+浓度对凝乳反应的影响'>5.3.2 Ca²⁺浓度对凝乳反应的影响
• 5.3.3 pH对凝乳反应的影响
• 5.3.4 反应温度对凝乳的影响
• 5.3.5 凝乳酶的热稳定性
• 5.4 实验结果
• 2+浓度对凝乳反应的影响'>5.4.1 Ca²⁺浓度对凝乳反应的影响
• 5.4.2 pH对凝乳反应的影响
• 5.4.3 反应温度对凝乳的影响
• 5.4.4 凝乳酶的热稳定性
• 5.5 小结
• 第六章 结论与建议
• 6.1 主要结论
• 6.2 建议
• 参考文献
• 附录一 实验药品及材料
• 附录二 实验仪器设备
• 致谢