下颌骨骨折愈合中降钙素基因相关肽对一氧化氮合酶调控作用的研究

论文摘要

骨折愈合过程是一个复杂的生理修复过程,感觉神经在骨折初始通过向神经中枢传递疼痛刺激参与了这一过程,最新研究证实在感觉神经术梢,骨痂组织中的神经肽类物质参与了骨折的修复重建。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）是其中分布最为广泛的一种神经肽,主要分布在代谢活跃的骨组织结构中,通过调节骨细胞发育、分化及活性,从而调节骨折愈合过程,其作用机制目前尚不清楚。研究发现一氧化氮（Nitric oxide,NO）作为一种信号传导分子在促进骨折愈合初期的血管生成,调节成骨细胞及破骨细胞活性等修复过程中都具有重要意义。一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase,NOS）的内皮型NOS（endothelial NOS,eNOS）和诱导型NOS（inducible NOS,iNOS）两个亚型在骨折整个过程中均有表达,发挥不同的生理作用,而神经元型NOS（neuronal NOS,nNOS）亚型在骨折愈合过程中是否表达目前在学术上尚存争论。eNOS所合成的低浓度的NO可以促进成骨细胞（Osteoblast,OB）的增殖及其骨基质分泌功能,还可以促进破骨细胞（Osteoclast,OC）前体向OC转换,提高OC的细胞活性,从而正调控骨折愈合。由细胞因子诱导iNOS产生的较高浓度NO对细胞却有明显的细胞毒性作用,高浓度的NO可降低OB活性、抑制其DNA合成、细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素产生,对骨折愈合产生负调控作用。在骨折愈合过程中,CGRP是否通过对NO的调控行使了促进骨折愈合这一调控机制?本实验旨在建立失神经下颌骨骨折模型,改变骨痂中的CGRP表达和分布,从而研究骨痂中CGRP的改变对NOS的蛋白表达、酶活性所产生的影响;体外实验加入外源性CGRP培养成骨细胞,通过检测成骨细胞培养液中的NO浓度和细胞NOS的表达和活性,研究CGRP对成骨细胞NO生成的调控作用。方法:动物实验:将48只实验用成年中国大白兔随机分为实验组（左侧IAN横断+左侧下颌骨骨折组、24只）及对照组（左侧IAN暴露+单纯左下颌骨骨折组、24只）。通过改良以往失神经及下颌骨骨折模型的方法,建立更加稳定、合理的兔失下齿槽神经支配下颌骨骨折愈合的动物实验模型。两组动物分别于术后4、7、14、28天各处死6只。获取骨折部位骨痂,液氮冷冻0.5g新鲜骨痂,NOS分型试剂盒检测iNOS和eNOS活性,免疫印染法（Western blot）检测iNOS和eNOS蛋白表达;其余部份骨痂组织脱钙固定后,免疫组织化学方法对两组动物骨痂组织中CGRP、eNOS及iNOS的表达进行检测,分析骨折愈合速度、方式和骨痂质量。细胞培养:为进一步观察CGRP对eNOS及iNOS表达和酶活性的影响,培养了新生兔颅骨成骨细胞,经形态学观察及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色鉴定后,分别向培养液中加入不同浓度的外源性人降钙素基因相关肽（hCGRP）,用含10%小牛血清的1640培养液配制成10-10、10-9、10-8和10-7 mmol/L四个浓度梯度组。设定含10%小牛血清的1640培养液所培养的细胞为对照组,在细胞培养的0.5h、1h、4h、12h和24h时间点,分别使用NO试剂盒检测细胞培养液中的NO浓度,Western blot检测细胞中iNOS和eNOS表达;NOS分型试剂盒检测细胞iNOS和eNOS活性;MTT法和茜素红染色法分别检测成骨细胞增殖能力和矿化能力。结果:动物实验结果:（1）骨痂组织学观察:对照组骨痂组织中新生骨小梁粗大致密、排列规则,且生长速度较快;实验组骨小梁排列稀疏而不规则,骨痂结构存在缺陷,类骨质及骨吸收空腔较多。（2）CGRP免疫组化染色:对照组骨折后7天骨痂中即可见CGRP阳性神经纤维,沿血管分布,14天在编织骨边缘有大量的CGRP阳性神经纤维,CGRP的表达达到峰值,28天仍较多;实验组骨痂中的CGRP呈弱阳性表达,图像光密度半定量分析结果显示在4-14d两组间CGRP表达量有统计学差异（p＜0.05或p＜0.01）。（3）eNOS和iNOS免疫组化染色:eNOS于骨痂血管内皮细胞的胞浆和胞膜中表达阳性,其中4d、7d时段实验组和对照组之间有显著差异（p＜0.05或p＜0.01）;iNOS于骨痂成骨细胞、破骨细胞和成纤维细胞的胞浆和胞膜中表达阳性,各时段两组表达差异无统计学意义。（4）新鲜骨痂中eNOS和iNOS表达:Western blot分析显示骨痂中eNOS在术后4d表达量最高,随后逐渐降低,14d后保持基本恒定;在4d时段实验组条带蛋白表达量明显低于对照组（p＜0.01）。iNOS的表达量在骨折愈合过程的4d-28d是处于增高趋势,在实验组和对照组之间无统计学差异。（5）新鲜骨痂中eNOS和iNOS活性检测:NOS活性检测实验发现在4d、7d时段eNOS的酶活性实验组显著低于对照组（p＜0.01）,而iNOS的酶活性实验组在14d、28d显著低于对照组,其余时段无统计学意义（p＜0.01）。细胞培养实验结果:（1）新生兔颅骨成骨细胞培养后,培养细胞在倒置显微镜下观察,见细胞形态不规则,多呈三角形、多角形。ALP染色显示成骨细胞胞质内灰黑色颗粒和块状沉淀,证明所培养的细胞为成骨细胞。（2）细胞培养液中NO浓度检测:实验组0.5-4h时段,培养液NO浓度明显高于对照组（p＜0.05或p＜0.01）,12h后无明显差别。（3）成骨细胞eNOS和iNOS表达检测:Western blot检测显示,实验组eNOS条带灰度值高于对照组。定量分析结果表明与对照组灰度值比较,12h实验组不同浓度CGRP作用下的eNOS蛋白表达均显著升高（p＜0.05或p＜0.01）。而iNOS蛋白表达量与对照组相比差异不明显,无统计学差异。（4）成骨细胞eNOS和iNOS活性检测:在早期0.5-4 h时段不同浓度的CGRP实验组的eNOS活性明显高于对照组（p＜0.01）,24 h后无明显差别。iNOS各实验组与对照组的差异无统计学意义。（5）成骨细胞增殖和矿化的检测:在CGRP作用24h,MTT法检测实验组细增殖能力显著高于对照组（p＜0.05或p＜0.01）;在CGRP作用14d后,茜素红染色检测到实验组细胞矿化结节明显多于对照组（p＜0.01）。结论（1）本实验所采取的实验动物模型有效地改变了骨痂部位CGRP表达和分布,失神经支配使骨折部位CGRP表达显著减少,形成的骨痂有明显的结构缺陷,同时骨折愈合速度减慢。（2）骨折愈合过程中,CGRP阳性神经纤维的分布与骨修复能力密切相关,表明CGRP在骨折愈合过程中发挥重要的调节作用。（3）在骨痂愈合过程中eNOS和iNOS的表达和活性具有明显的时效性,在骨折愈合的不同阶段具有重要意义,直接调控骨折愈合过程。（4）体内、外实验均表明,CGRP表达与eNOS的表达和活性呈正相关,而对iNOS调控有待于进一步探讨。CGRP能够上调细胞合成NO的能力,因此,NO/NOS系统可能是CGRP参与骨折愈合调节的一条信号途径。（5）CGRP对成骨细胞的增殖和矿化能力具有促进作用。

论文目录

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• 论文正文 下颌骨骨折愈合中降钙素基因相关肽对一氧化氮合酶调控作用的研究
• 前言
• 实验一 失IAN支配下颌骨骨折愈合过程中CGRP对NOS的调控
• 材料与方法
• 结果
• 实验二 外源性CGRP对成骨细胞NOS表达和活性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 一氧化氮在骨折中的作用及其调控机制
• 参考文献
• 在读硕士期间发表论文