DMN诱导肝损伤小鼠凝血调控系统改变及肝毒清对其干预作用的研究

论文摘要

重型肝炎以死亡率高著称,也称为肝衰竭,表现为短期内肝功能急剧恶化,出现肝性脑病和凝血功能障碍,凝血酶原活动度（PTA）小于40%。重型肝炎可由多种病因引起,主要病因有病毒性、酒精性、自身免疫性、药物性和中毒性,另有少部分患者病因不明。在我国,重型病毒性肝炎占很高的比例。长期以来,重型肝炎的发生机制不清楚,内科治疗缺乏有效手段。目前,重型肝炎病死率为50%-80%。越来越多的研究表明肝细胞大量坏死及缺乏有效的肝再生是重型肝炎死亡的主要原因。因此,明确重型肝炎的发病机制,寻找敏感的反映肝损害程度和肝再生的生化指标,在重型肝炎早期阻止肝细胞凋亡、促进肝再生是提高重型肝炎患者生存率的关键。而这一切都需要有比较好的重型肝炎的动物模型作为研究工具才能够取得进步。我们近年来通过DMN诱导小鼠肝损害,选择合适的DMN剂量,一次性腹腔注射,可使小鼠肝组织大片坏死,出现肝脏缩小,出现腹水；大约1/3的小鼠死亡。大部分小鼠严重肝损害在造模后36-48h时达到高峰。因此从该模型的病理损害看,该模型肯定是一个类似重型肝炎的模型；且该模型病理损害持续时间久,完全可以用作中药治疗重型肝炎效果的评价模型。本研究试图通过观察该模型凝血系统在造模后的变化,进一步证实该模型与人类重型肝炎类似,并观察中药对该模型凝血系统的影响,以表明中药治疗重型肝炎的效果及优势。1DMN诱导的肝损伤模型小鼠外周血凝血酶原时间及凝血酶原活动度的动态变化雄性昆明小鼠50只,随机取出4只小鼠作为空白对照组,腹腔注射生理盐水,10ml/kg；其余36只小鼠均腹腔注射DMN造模,造模剂量为15mgDMN/kg。造模后6h、12h、24h、36h、48h、72h、120h分别取造模组小鼠4只处死,留取血浆、肝组织标本；肝组织标本在取出后照相,留取50mg左右用生理盐水洗干净后投入含1mlTrizol的离心管中,用于mRNA检测。另取适量置于多聚甲醛中固定,用于病理检测。本实验的PT检测结果显示,PT在造模24h的时间点即表现为明显延长,一直持续到120h观察结束时,这显示了自造模24h开始即显现为凝血系统受到了显著影响。由此而计算得到的PTA结果显示,PTA也在造模后24h的时间点开始降低,在造模后36h至96h时低于40%,而至120h时微升至41%。这说明,自造模后24h开始直至观察结束的120h时,说明肝组织凝血因子的分泌明显减少,而这与肝组织病理损害严重程度一致。所以从肝组织病理损害和PT.PTA来看,DMN诱导的小鼠肝损害模型完全符合重型肝炎的标准,DMN诱导的小鼠肝损害模型可作为重型肝炎模型。2凝血系统相关因子mRNA在DMN诱导的小鼠肝组织的表达以定量PCR检测凝血系统相关的凝血因子、纤溶因子等的变化情况。实验结果显示,凝血因子的mRNA量只有F2、F11、F13B三种有明显改变,大部分凝血因子mRNA的量与肝组织病理表现及凝血酶原时间的表现不符合,而凝血、纤溶调控因子则与肝组织病理和凝血酶原时间的结果基本符合。这说明,DMN诱导的重型肝炎小鼠模型除了凝血因子减少外,凝血、纤溶调控系统也起到促进凝血酶原时间延长的作用。3中药复方对DMN诱导的小鼠重型肝炎模型凝血、纤溶调控系统的影响昆明小鼠50只,分为空白对照组、模型对照组、中药高剂量组（20g生药/kg.次）、中药中剂量组（10g/kg.次）、中药低剂量组（5g/kg.次）、联苯双酯组（150mg/kg.次）,模型组灌胃生理盐水100ml/kg.次。每组10只。腹腔注射DMN造模,15ul/kg,每12h给药一次,48h后采集标本,眼球采血,收集血浆用于检测凝血酶原时间；其中肝组织标本留取50mg左右用生理盐水洗干净后投入含1mlTrizol的离心管中,将部分肝组织固定于多聚甲醛中以备免疫组化染色。结果显示,复方肝毒清高剂量组能显著改善DMN诱导的小鼠重型肝炎的PT及PTA,增加PAI-1、TAFImRNA表达量；减少t-PA、u-PAmRNA表达量,使凝血纤溶调控系统的促血凝功能加强、促纤溶功能减弱,这可能是复方肝毒清改善DMN诱导的重型肝炎模型的肝组织病理的重要机制之一。全文结论1 DMN诱导的小鼠肝损害模型的病理表现完全符合重型肝炎的病理表现,可以作为重型肝炎模型。2 DMN诱导的小鼠肝损害模型凝血、纤溶调控系统各主要细胞因子mRNA量出现显著变化,而凝血因子中只有F2、F11、F13B的mRNA出现明显变化。3中药复方肝毒清高剂量组对DMN诱导的小鼠肝损害模型的凝血、纤溶调控系统有着显著的改善作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 1 凝血系统与肝脏
• 1.1 凝血因子及其作用机制
• 1.2 遗传的和获得性的出血性疾病
• 1.3 遗传和获得性的血栓形成紊乱
• 2 重型肝炎的发生机理
• 2.1. 病毒的直接作用
• 2.2. 宿主的免疫反应
• 2.3 细胞凋亡
• 2.4 凝血系统的作用
• 2.5 其他因素的作用
• 3 重型肝炎的诊断
• 3.1 重型肝炎的具体诊断标准
• 3.2 重型肝炎概念和分类争论
• 4 肝损害的动物模型研究进展
• 4.1 化学性肝损伤动物模型
• 4.2 药物性肝损伤模型
• 4.3 免疫性肝损伤动物模型
• 4.4 酒精
• 4.5 其他
• 第二部分 实验研究
• 1 DMN诱导的肝损伤模型小鼠凝血酶原时间及凝血酶原活动度的动态变化
• 1.1 材料和方法
• 1.2 实验结果
• 1.3 讨论
• 2 凝血因子mRNA在DMN诱导的小鼠肝组织的表达
• 2.1 材料和方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 3 中药复方对DMN诱导的小鼠重型肝炎模型凝血、纤溶调控系统的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录:缩略词表
• 致谢