重楼总皂苷作用人肝癌细胞系HepG2的蛋白质组学研究

论文摘要

目的:通过研究重楼总皂苷（Rhizoma Paridis total saponin,RPTS）对人肝癌细胞株HepG2蛋白质表达谱的影响,寻找RPTS抗肿瘤作用的相关蛋白。方法:①按照皂苷提取方法制备RPTS。②MTT比色法检测RPTS对HepG2细胞增殖的影响,流式细胞仪（Flow cytometry,FCM）分析RPTS处理HepG2细胞后凋亡和细胞周期的改变。③应用固相pH梯度（ImmobilizedpH gradient,IPG）双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术分离RPTS处理组(IC50浓度作用48h)和对照组HepG2细胞的总蛋白,胶体硝酸银染色,图像扫描获取处理组和对照组总蛋白质的2-DE图谱后,使用ImageMaster软件分析比较两组间差异表达的蛋白质,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）测得经胶内胰酶酶解的差异蛋白点肽质量指纹谱（Peptide mass fingerprint,PMF）,用Mascot软件查询NCBI蛋白质数据库。结果:①成功获取RPTS并经TLC、HPLC等方法鉴定。②RPTS对HepG2细胞增殖具有抑制作用,并呈剂量和时间依赖关系。MTT法提示RPTS作用HepG2细胞48h的IC50为10±1.2μg/ml。FCM检测发现RPTS能够诱导HepG2细胞凋亡,引起HepG2细胞S期阻滞。③根据MTT分析和FCM检测结果,选择10μg/ml RPTS干预HepG2细胞48h进行蛋白质组学（Proteomics）分析,所获2-DE图谱分辨率较高、重复性较好。RPTS处理组和对照组平均蛋白质点数分别为1690±25和1700±39,平均匹配的点数分别为1394±17和1421±13,匹配率达82.5%和83.6%。RPTS处理组与对照组不同胶之间蛋白质点在等电聚焦（Isoelectric focusing,IEF）方向的偏差是1.232±0.218 mm,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）方向上的偏差为1.126±0.142mm。两组间共有51个差异表达蛋白点,RPTS处理组有31个蛋白质点下调,20个蛋白质点上调。选择表达量差异较明显的15个差异点（差异2倍以上）行质谱分析,获得15张PMF图谱,经查询数据库初步鉴定12个蛋白质,部分蛋白与肿瘤发生、发展、进展相关,如dUTP焦磷酸酶（dUTP pyrophosphatase,dUTPase）,异种核糖核蛋白K（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP K）,GMP合酶（GMP synthase）,脱氧核糖核酸內切酶γ（DNasegamma）,核苷酸二磷酸激酶A（Nucleoside diphosphate kinase A,NDKA）等。结论:RPTS对HepG2细胞增殖具有抑制作用,并且能够诱导细胞凋亡和影响细胞周期。RPTS抗肿瘤作用可能与dUTPase,hnRNP K,GMPsynthase,DNase gamma,NDKA等蛋白直接或间接相关,通过对这些蛋白的深入研究,将有助于进一步阐明RPTS抗肿瘤作用机制及肿瘤治疗药物新型靶点的发现。

论文目录

• 英文缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）概述
• 2中药杭肿瘤作用
• 3 重楼的抗肿瘤应用
• 4 蛋白质组学概述及其在药物研究中的应用
• 技术路线
• 第一部分 重楼总皂苷制备
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.分析与讨论
• 5.结论
• 第二部分 重楼总皂苷对人肝癌细胞系HepG2细胞毒性作用
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.分析与讨论
• 5.结论
• 第三部分 重楼总皂苷作用人肝癌细胞系HepG2的蛋白质组学研究
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.分析与讨论
• 5.结论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表文章
• 综述