抗真菌双T-DNA植物表达载体构建及农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化

论文摘要

玉米（Zea mays L.）是重要的粮食、饲料及工业原料，在国民经济中发挥着重要作用。面对日益严峻的粮食安全问题，如何在有限的耕地上解决粮食增产问题成为作物育种中面临的主要难题。就玉米生产而言，通过杂种优势提高产量的空间逐渐缩小，只能依靠玉米品种抗逆性的增强以提高产量水平。真菌性病害是危害玉米生长、影响产量和品质的主要病害，有效控制真菌性病害对玉米生产具有重要意义。采用基因工程手段将抗真菌基因导入玉米材料是抗病育种的新途径，多种方法已被应用于玉米遗传转化研究，农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法具有受体材料基因型限制小、取材不受季节约束，转化周期较短等优点，同时拓宽了玉米遗传转化受体材料类型。双T-DNA载体系统是一种培育无选择标记转基因植株的快速有效的方法，经过筛选后的共转化植株经过自交分离，可以得到不含选择标记基因的转基因植株，有效解决了转基因作物的安全性问题。为获得具有抗真菌性病害的玉米种质新材料，本试验构建了含有Chi-linker-Glu融合基因的双T-DNA植物表达载体并开展了农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化研究，取得了如下结果：1.以pCAMBIA1300-EPSPS为基础载体，用限制性酶切技术切除载体上的多余酶切位点，得到中间载体pCAMBIA1300-EPSPS/HE及pCAMBIA1300/HX。进一步采用PCR扩增pCAMBIA1300/HX载体中含HindⅢ位点的左右边界区，将扩增产物连接至中间载体pCAMBIA1300-EPSPS/HE的SphⅠ位点，得到了双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1300-EPSPS-2T。2.采用分步酶切和连接方法，将含有抗真菌融合基因的线性表达单元Ubi-Chi-Linker-Glu-Nos连接至双T-DNA载体的HindⅢ位点，得到了双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1300-EPSPS-2T-Chi-Linker-Glu。用具有草丁膦抗性的bar基因替换EPSPS基因，同时获得了具有草丁膦抗性基因的双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1300-bar-2T-Chi-Linker-Glu，采用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404，得到了用于遗传转化的农杆菌工程菌。3.通过对农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系的研究，得到的最佳转化体系为LBA4404菌液浓度OD600为0.6、乙酰丁香酮浓度为150μmol/L、50kPa负压下侵染12min。4.以玉米骨干自交系郑58作为受体材料，采用农杆菌介导的茎尖遗传转化方法，将含有抗真菌融合基因Chi-Linker-Glu及除草剂抗性基因的双T-DNA植物表达载体转化玉米茎尖，获得了33株抗性植株，采用PCR鉴定结果表明有13株为阳性植株，有3株正常结实，最终转化率为2.6%。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• Ⅰ文献综述
• 1 农杆菌介导的玉米遗传转化技术研究进展
• 1.1 农杆菌介导的玉米遗传转化发展历程
• 1.2 农杆菌介导玉米遗传转化的受体
• 1.3 农杆菌介导玉米遗传转化的菌株及载体
• 2 转基因植物安全性策略研究进展
• 2.1 使用安全的选择标记基因
• 2.1.1 糖类代谢酶基因
• 2.1.2 化合物解毒酶基因
• 2.1.3 植物抗逆相关基因
• 2.2 去除选择标记基因
• 2.2.1 共转化法
• 2.2.2 转座子系统
• 2.2.3 位点特异性重组系统
• 2.2.4 染色体内重组系统
• 3 植物抗真菌基因工程研究进展
• 3.1 主要的抗真菌病害基因
• 3.1.1 几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因
• 3.1.2 核糖体失活蛋白基因
• 3.1.3 植物抗毒素基因
• 3.2 几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶融合蛋白基因的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 5 研究技术路线
• Ⅱ材料与方法
• 1 材料
• 1.1. 菌种和质粒
• 1.2 玉米材料
• 1.3 工具酶和试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 培养基
• 2 方法
• 2.1 抗真菌双 T-DNA 植物表达载体构建
• 2.1.1 载体 pCAMBIA1300-EPSPS 基础载体质粒 DNA 的提取
• 2.1.2 pCAMBIA1300-EPSPS/HE、pCAMBIA1300-EPSPS/HX 构建
• 2.1.3 LB-HindⅢ-RB 线性片段的扩增及回收
• 2.1.4 pCAMBIA1300-EPSPS/HE-2T 载体的构建
• 2.1.5 pCAMBIA1300-EPSPS-2T-Chi-linker-Glu 的构建
• 2.1.6 植物表达载体 pCAMBIA1300-bar-2T-Chi-linker-Glu 的构建
• 2.1.7 植物表达载体转化根癌农杆菌及其鉴定
• 2.2 农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化
• 2.2.1 农杆菌工程菌的制备
• 2.2.2 除草剂筛选浓度的选定
• 2.2.3 农杆菌转化玉米茎尖
• 2.2.4 转化苗的移栽和除草剂筛选
• 2.2.5 农杆菌介导的玉米茎尖转化体系优化
• 2.2.6 转基因玉米植株的分子检测
• Ⅲ结果与分析
• 1 抗真菌双 T-DNA 植物表达载体构建
• 1.1 pCAMBIA1300-EPSPS/HE、pCAMBIA1300/HX 构建
• 1.2 pCAMBIA1300-EPSPS-2T 的构建
• 1.3 抗真菌双 T-DNA 植物表达载体构建
• 1.4 植物表达载体转化根癌农杆菌及其鉴定
• 2 农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化
• 2.1 转化玉米植株对 Basta 的抗性及适宜筛选浓度的确定
• 2.2 农杆菌介导玉米茎尖遗传转化条件的选择
• 2.2.1 菌液浓度对转化率的影响
• 2.2.2 侵染时间对转化效率的影响
• 2.2.3 不同菌株对遗传转化效率的影响
• 2.2.4 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响
• 2.2.5 真空渗透对转化效率的影响
• 2.3 抗性植株的获得
• 2.4 转基因玉米植株分子检测
• 2.5 T1代转基因植株种子的获得
• Ⅳ讨论
• 1 通过双 T-DNA 载体系统培育安全转基因作物
• 2 除草剂最佳筛选浓度的确定
• 3 玉米茎尖遗传转化条件的选择
• 3 转基因植株的分子检测
• 4 抗性植株的后期管理
• Ⅴ结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介